基因泰克

[size=3]近日，记者在内蒙古自治区鄂托克旗召开的“转基因克隆绒山羊培育成果通报会”上获悉，不久前，位于鄂托克旗的“内蒙古白绒山羊种羊场”诞生了目前国际上规模最大的一批转基因克隆绒山羊，这标志着中国绒山羊现代生物育种技术又有了新的突破。 　　这项研究为国家转基因生物新品种培育重大专项课题，由内蒙古大学生命科学学院实验动物研究中心研究员刘东军带领的研究团队，在中国工程院院士旭日干的指导下取得的一项具有国际先进水平的科研成果。 　　此研究团队成功构建了对绒毛生长有促进作用的转胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因载体，利用该载体成功转染了绒山羊胎儿成纤维细胞，建立起转基因细胞系。再利用转基因细胞进行体细胞克隆，从而获得的转基因绒山羊。 　　2009年9月至10月，这个研究团队在位于鄂托克旗草原上的内蒙古白绒山羊种羊场开展绒山羊转基因克隆胚胎的生产和移植工作。今年2月至3月陆续获得羔羊17只，其中转基因克隆羔羊14只、体细胞克隆羔羊3只。 [/size]

一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传（1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。（2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。（4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。（5）质粒的酶切。虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究，决定着克隆的成败。质粒提取我一般都用试剂盒，天根的很便宜了，现在好像一盒已经六折，一盒有200个，可以用很久。质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定，根据A260的值计算出质粒的量，然后再进行酶切，一般酶切体系60ul，60ul体系中我只切总量1ug的质粒，一次切两管，酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收，这取决于两个限制性内切酶之间的距离，十几bp以内我就直接回收了，如果偏大就要切胶回收。（6）连接 连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶，它的特点是22度连接三小时以上几款，这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接，连接一个白天，到下午可以做转化了，涂板，过夜培养第二天早上看结果。然后挑克隆（一般我一个基因就挑四个克隆足已）培养一白天，下午稍晚些提质粒，然后马上酶切鉴定，一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系，酶用0.5微升就够了（呵呵，该省的就省点吧），酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了。这样从PCR到克隆鉴定完毕，一共三天。不过从我带学生的经验来看，从一个懵懵懂懂的新手到成功掌握该技术快则半个月，多则一个月，引人而异。各位也试试看吧！以上为本人在基因克隆方面的一家之言，难免有疏漏或过于肯定之处，感谢各位战友多提宝贵意见，多多交流，以后我会陆续贴出各种技术的实验心得，欢迎大家相互交流！

关专家断言，只需20克超级基因武器，就足以使60亿地球人死于非命。基因武器的问世不会晚于2010年。各国政府有必要采取紧急措施，以制止基因武器的研制与扩散。人类千万不能打开基因武器这只“潘多拉匣子”，因为基因武器一旦问世，人类将面临巨大的灾难。　　基因武器引发恐慌　　《俄罗斯报》发表特约撰稿人波格丹诺夫的文章。在文章中，波格丹诺夫提出：在非洲某个“神秘岛”上，有人正在秘密试验一种新型生物武器，这就是被称为“种族炸弹”的“基因武器”。　　波格丹诺夫在文章中指出：英国医学协会前不久发布的《生物工程技术———人类武器》专题报告中预测说，一种杀伤力空前的“种族武器”近年内即将问世。根据基因武器的特殊性能可以预计，一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发生巨大变化。基因武器使用者再也不用兴师动众，而只需要在临战前将经过基因工程培养的病菌投入他国，或利用飞机、导弹等将带有致病基因的微生物投入他国交通要道或城市，让病毒自然扩散、繁殖，使敌方人畜在短时间患上一种无法治疗的疾病，从而丧失战斗能力。　　此外，基因武器可根据需要任意重组基因，可在一些生物中移入损伤人类智力的基因。当某一特定族群的人沾染上这种带有损伤智力基因的病菌时，就会丧失正常智力。另一方面，基因作为战术武器使用时，将使对方防不胜防，束手无策。基因武器的特有功能之一，就是从武器的使用到发生作用都没有明显的征候，即使发现了也难以***遗传密码和实施控制。英国医学会还提请国际公众注意两个重要事实：其一，许多国家都在绝密的状态下进行新的分子生物技术实验。其二，1972年签订的《禁止生物武器公约》，没有对公约履行情况的检查机制作出规定。　　难以控制和防治　　与造价昂贵的大规模杀伤性武器相比，杀人不见血的基因武器有着无可比拟的优势。有人估算，用5000万美元建造一个基因武器库，其杀伤效能将远远超过 50亿美元建造的核武器库。基因武器的使用方法非常简单，而且难以防治。基因武器可以用人工、普通火炮、军舰、飞机、气球或导弹进行施放，可以投在对方的前线、后方、江河湖泊、城市和交通要冲使疫病迅速传播。　　有关专家认为，发展基因武器可能产生一些人类在已有技术条件下难以对付的致病微生物，从而给人类带来灾难性的后果。由于每一种基因就像一把特制的锁，只有研制者才知道它的遗传密码，对方是很难窥破其秘密并加以控制和防治的。这使得基因武器比其它武器具有更好的保密性。即使明明知道敌人使用了基因武器，要查清病毒来源与属性也需要很长的时间。1995年，当美国西南部流行一种名为 hantavirus的病毒时，美国科学家动用了世界上最先进的研究手段，用了5天时间才查明病毒属性，找出抗病毒方法。当时领导科研人员战胜han鄄 tavirus病毒的美国著名病毒学家弗莱克·扬格目前也倡议建立“反恐怖基因工程”，以破译细菌及病毒的基因密码，从而为制造基因武器创造可能。他说，这一工程技术将有可能在短时间内鉴别出，哪些人群的遗传基因具有攻击性，并有针对性地制造相应的疫苗。据披露，美国政府今年将拨款20亿美元用于生物工程研究。　　基因武器研制传闻　　在美国旧金山举行的“美国科学进步协会”2001年年会上，生物学家莫瑞诺披露，在前南非种族隔离政府统治时期，南非军方曾致力于研制一种专门针对黑人的生物制剂。他们对如何使有色人种的妇女绝育特别感兴趣。与传统的生物武器相比，这种新式的基因武器则更加隐蔽。前者只是简单地通过破坏人体神经系统来达到杀人目的，而后者则可以影响人口出生率、婴儿死亡率、发病率甚至农作物产量。通常在受到这种生物武器袭击数10年后，它的后果方才显现出来。　　英国《星期日泰晤士报》曾于1998年9月披露一则秘闻：为了报复伊拉克的导弹袭击，以色列军方正在加紧研制一种专门攻击阿拉伯人而对犹太人没有危害的基因武器——“人种炸弹”。“人种炸弹”的研制计划由以色列的尼斯提兹尤纳生物研究院负责，该研究院是以色列研制生化武器的秘密中心。　 纽约时报》网络版披露了一条惊人消息：据美国一些官员透露，在过去的几年中，美国已经开始进行一项研究基因武器的秘密计划。位于马里兰州的美国军事医学研究所，其实就是基因武器研究中心，那里的研究人员已经研制了一些具有实战价值的基因武器。　　俄罗斯情报人员认为，世界上约有10至15个国家已经制定或正在制定基因与生物战计划，其中一些国家被怀疑实行国家恐怖主义。　　俄罗斯被认为拥有世界上最大的生物武器和化学武器储备，也是世界上核武器储备最多的国家。据前苏联细菌战研究部门叛逃者肯·阿利别克博士说，俄目前有4 个从事基因类生物武器研究的主要试验室。俄罗斯也早就着手研究剧毒的眼镜蛇毒素基因与流感病毒基因的拼接，试图培育出具有眼镜蛇毒素的新流感病毒，它能使人既出现流感症状，又出现蛇毒中毒症状，导致患者瘫痪和死亡;