一道黑
第1楼2008/11/26
色谱法要点
萤光检测器的最佳激发波长在210到300nm之间.尽管光谱的吸收取决激发和发射波长,其结果与Gerhardt介绍的条件下相比灵敏度几乎高出了5倍。
尽管进行了两次净化在链霉素区段仍然常常会有小的干扰峰,这可以用改变色谱条件的办法去除。虽然采用了1-庚苯磺酸[2],链霉素的保留时间还是太长,所以不得不考虑提高乙腈比例来缩短保留时间。在乙腈比例为20%时杂质峰明显在链霉素出峰之前。最佳的总出峰时间溶剂系统B,乙腈的最终比例到22%,这样已使链霉素的保留时间缩短了7分多钟。用纯乙腈作为第二溶剂使我们进一步优化色谱条件,象缩短总运行时间,插入其他分离柱来把链霉素与杂质峰分开。在改变液相色谱条件和柱后衍生化条件,就是说不同的流速条件下可以看到衍生化的pH值大约为12.5。(测量池后测量的pH值!)。较低的pH值会明显降低灵敏度,而pH值过高则可能损坏系统,因为厂家已经声明测量池使用pH值不得高于9。由于必须使用高pH值,仪器系统在样品测量完后必须彻底清洗。
在大约连续进20个样和标样后常常会出现拖尾,更换预柱是获得良好峰形,提高灵敏度的原则。由于污染和外标溶液常常会出现标样峰加宽。因此在改变样品时常常测定一系列标准,这样可以达到链霉素恒定半峰宽为0.6分钟的水平。
分析和讨论
讨论是根据外标(标准曲线)进行的,不过对于“原样”或加标样来说与外标相比保留时间漂移大约1%,链霉素平均出峰时间要提前0.1到0.2分钟。因此每次测定时也应该测定一个加标样。
图1.为某空白蜂蜜样和加有30μɡ/kg链霉素的同一蜂蜜的色谱图。图2.为相应外标的色谱图。图2中所
加外标为0.1μg/mL(相当于样品中10μg∕㎏链霉素)表示了本法的检测灵敏度,其信号仍有基线噪音水平的六倍。
加标实验在三个浓度水平进行,中间(18个点)回收率为78%(表1)
在给定条件下也可以同样测定双氢链霉素。它在链霉素之后流出,但是不管变化因素有多少也无法得到基线分离。与链霉素相比双氢链霉素的检测灵敏度只有一半,回收率相似。
实验结果与评估
到目前为止用两种方法平行地测定了59个蜂蜜样的链霉素。在Charm II的半定量结果和HPLC结果都有良好的相关性。
在表2中总结了HPLC法的实验结果。两批商品花蜜发现链霉素含量最高达到43μɡ∕㎏。目前这些蜂蜜(中国和墨西哥)只有一种确定了来源。另一批的链霉素含量达到27μɡ∕㎏是从墨西哥,法国,和罗马尼亚蜜混合成的。在欧洲森林蜜(从土耳其,保加尼亚,意大利,波兰和罗马尼亚蜜混合成的)中也可以检测出链霉素。在成品蜜中,主要是来自Bdensee 地区和硬核果树栽培地区没发现链霉素残留。
双氢链霉素主要用作兽药,在蜂蜜中没发现残留。这就加强了链霉素残留不是由于非法使用链霉素作为蜜蜂兽药的观点,而认为是把植物抗生素用在农业上作植物保护剂,蜂蜜又是从此获得的缘故。在德国植物抗生素的使用仅限于经批准的例外情况下,因此现在在“最高残留限量VO”(VO=法定)的框架内并没有对它规定最高允许量。在用作卫生医药时对牛,羊,猪和禽链霉素和双氢链霉素允许临时MRL(限量)高达1.6.2000。牛奶的MRL值为200μg∕㎏,肌肉,肝,和脂肪为500μɡ∕㎏,肾脏为1000μɡ∕㎏。因此这次实验所确定的残留实际上都低于最基本的食品牛奶中卫生医药残留的允许最高限量。但是,在未来残留问题将始终引起关注,因为考虑到在德国“Feuerbrand”流传的越广,植物抗生素的使用也越广。相应的地产蜂蜜的残留也会出现。
表1. 不同浓度链霉素的回收率(%)
浓度(μɡ∕㎏) 20 30 50
1 81 82 72
2 92 82 79
3 72 83 77
4 71 82 65
5 80 75 68
6 86 77 78
平均 80.3 80.2 73.2
标准偏差 8.1 3.3 5.8
变异系数(%) 10.0 4.1 7.9
表2. 实验结果
数目 <10 →20 →30 >30
商品蜜
花蜜 (一般) 27 19 31 31 2
加工蜜(特定) 8 8
原蜜 13 10 32
成蜜3
花蜜 8 8
原蜜 3 3
总计 59 48 6 3 2
1从一个生产厂所取的具有相同品质但不同批次的3个样品
2一个生产厂所取的具有相同品质但不同批次的样品
3来自Tubingen 地区(巴登-威登堡)
图1.加入30μɡ∕㎏的样品蜜和控制样的色谱图(回收率82%)
图2.外加0.3ńɡ∕μL和0.1ńɡ∕μL链霉素标准(分别相当30μɡ∕㎏和10μɡ∕㎏蜂蜜样)的色谱图
译者 校者
参考资料
1. Usleber E, Dietrich R et al. (1995) Arch Lebensmittelhyg 46:94-96
2. Gerhardt G. Salisbury C, MacNeil J (1994) J Assoc Off Anal Chem 77:334-337
3. Charm Science Inc, Malden/USA (1995) Operator’s Manual zum Charm II Test for Antimicrobial Drugs in Tissue
4. R-Biopharm GmbH (1996) Testbeschreibungizum Enzymimmunossay zur quantitativen Bestimmung von Streptomycin und Dihydrostreptomycin
5. Euro-Diagnostica, Transia (1996) Testbeschreibung zum Immunoezymatischen Nachweis von Streptomycin
6. VO uber Hochstmengen an Ruckstanden von pflanzenschutz- und Schadlingsbekampfungs-mitteloin, Dungemitteln und sonstigen Mitteln in oder auf Lebensmitteln und Tabakerzeugnissen vom 1.9.1994 (BGBI.IS.2299) I.d. aktuellen Fassung
7. EWG-VO 1140/96 (ABI. Nr. L 151/6 ff) zur Festsetzung von Hochstmengen fur Tierarzneimittel-ruckstande in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs