一道黑
第1楼2008/11/26
9. 检测步骤
9.1 检测样品的制备。
9.1.1 肉:取在0-4℃新鲜的肌肉组织样品并剁碎,对于冻肉,解冻后剁碎,混匀。样品待测前应在0-4℃中保存,并在48小时内分析。如要贮存较长时间,则应在-20℃以下冷冻或最好在-80℃冷冻,保证其稳定。
9.1.2 蛋:均质
9.1.3 牛奶:原料奶或任何经均质但未变性的经加温的牛奶。
9.2 肉和蛋的预提取处理
9.2.1 将3g粉碎肉或均质蛋置于离心管中
9.2.2 蛋样:滴加5ml惭腈,搅拌。 肉样:加8ml的乙腈/4%氯化钠的溶液(6.3.6) 。
9.2.3 充分混合成均质。
9.2.4 4000g离心10min
9.2.5 称取并转移至样品瓶中。
9.2.6 移取约1/6 (w/w)上清液至具盖的玻璃离心管中
9.2.7 加5m正已烷和2ml水并充分混和.
9.2.8 1700g离心5min
9.2.9 弃去上层
9.2.10 重复9.27至9.29步骤
9.2.11 加3.5ml经乙酸乙酯饱和并混匀的水
9.2.12 1700g离心5min
9.2.13 分取有机相,并将其蒸发至干。
9.3 牛奶的提取
9.3.1 取1mL牛奶于玻璃试管中,加入0.75mL三氯甲烷/异辛烷(3/2, v/v) 混匀.
9.3.2 4000g离心15min
9.3.3 取0.7mL上清液于C18小柱上。小柱预先按下列顺序进行处理:
5mL甲醇;5mL氯仿;5mL甲醇和10mL蒸馏水淋洗。
9.3.4 样品经10mL蒸馏水(9.1.19)淋洗
9.3.5 加5mL乙腈/水(1/1, v/v)洗脱.
9.3.6 加5mL水(经乙酸乙酯饱和)抽提洗脱液中的氯霉素, 1700g离心
9.3.7 移取上层液,用真空浓缩器浓缩至干
9.3.8 加0.7mL磷酸盐缓冲液(6.3.1)溶解残余物,按9.5.2步骤操作
9.4 (原文无)
9.5 放射免疫分析
[注意:所有操作步骤必须在0℃的冰浴中进行]
9.5.1 用450mL磷酸盐缓冲液(6.3.1)溶解肉/蛋提取液(9.2.13)。肉的提取液用缓冲液稀释约10倍,使氯霉素于缓冲液的浓度大约为150pg/200mL。
9.5.2 将下面溶液合并于玻璃试管中:
──200 L提取液(9.5.1或9.3.8)或标准溶液(6.2.2)
──200 L放射配体工作液(6.3.4)
──400 L抗血清工作液(6.3.3)
在最后加入抗血清后开始恒温。
[注意:每个样品平行测定两次]
9.5.3 在+4℃中恒温过夜
9.5.4 在每个管内加入1mL经充分搅和的活性炭悬浮液必需在5分钟内完成。
9.5.5 在0℃中孵育30分钟
9.5.6 1700g 离心10min
9.5.7 将上清液移入至足够量的液闪液中.
9.5.8 在闪烁仪中,计数10分钟或计数误差在2%之内.
10.0 结果计算
10.1 要求校正曲线计算结果时采用非线性程序是适宜的。
[注意:在RIA中,进校正氯霉素标样浓度和结合量/总量(B/T)之间分别为非线性最小二次方曲线拟合中的自变量和因变量.若B/T值经对数转换后,通常只有校正曲线的中心部分呈线性。]
对于样品中氯霉素含量的计算,需要下列数据:
A 每个试管中氯霉素量(两次平均值),这些值是从校正曲线中测得的。
F 校正因子,移入RIA管中的检测样品钻的比值。
EA 从原提取样液中取出用于净化部分的样液重量。
EW 原提取液重量。
SW 样品重量。
蛋样品
F=22.5,对于分析含量中10ppb时
EA=约为EW的六分之一,采用精确数值
EW=一般为5-6.5克,采用精确数值
SW=约为3克,采用精确数值
肉样品
F=22.5,对于分析其含量浓度为10ppb时
EA=约为EW的1/6,采用精确数值
EW=一般为7.5-9克,采用精确数值
SW=约为3克,采用精确数值
F=5,对于分析其中含量浓度为1ppb时
EA=约为1,对于分析含量在1ppb时
EW=约为1,对于分析含量在1ppb时
SW=约为1,对于分析含量在1ppb时。
结果计算式为:
A F EW
F = = ----------------------
1000 EA SW
10.2 精密度
在EEC用肉和牛奶做协同试验,测定结果如下:
肉 牛奶
实际含量( g/kg) 11.6 1.0
测得平均值( g/kg) 6.9 1.1
重复性(ng/g) 3.2 0.72
CV%(变异系数) 16 23
重现性(ng/g) 7.0 1.1
变异系数cv% 36 36
实验室间cv% 32 28
注1:这个数值未考虑回收率的校正。
本数据的分析按照ISO标准5725/1986进行。
10.3 质量控制
对下列每个分析对象必须重复检验两次包括:试剂空白,动物组织空白样品,用作添加的动物组织样,可能的话还有参考物质(标样)。
应测定移入每个分析试管的总放射量。
应测定非特异性结合放射配体的量,其值不能超过8%,
11 - 12 略
13. 样品质量控制
肌肉,牛奶和蛋的基准物质由BGA制备并按DG12测定和试验程序进行,最终相互比较和认证。
14 - 15 略
16. 检验流程图
肉/蛋----------------------------→溶剂提取
↓
牛奶---→溶剂提取---→C18 SPE小柱--→RIA----→测定结果