【原创】[第二届网络原创作品]EP2.6.12及2.6.13A

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平板计数法
a倾倒式平板法，用9CM的培养皿，每个培养皿中加入制备阶段制备好的样品1ml，在不超过45℃的条件下，加入15-20ml适于培养细菌液状琼脂（象介质B）或15-20ml适于培养真菌液化琼脂培养基（象介质C），如果用大的培养皿，琼脂量也要相应的增加，每种介质对每个等级的稀释溶液至少要有两个皮氏培养皿。培养平板在30-35℃培养五天（真菌20-25℃），除非在短时间内就可得到可靠数目。对应一个溶液选择平板，显示的最大集落数小于300（真菌是100），计算出每克或每毫升的算术平均数目及集落形成单位。
b表面扩散法，用9CM皮氏培养皿，加入15-20ml适于培养细菌的液状琼脂培养基（象介质B）或15-20ml适于培养真菌的液状琼脂培养基（象介质C）在约45℃条件下，允许固体化，如果用大的皮氏培养皿琼脂量也要相应的增加，将平板干燥,例如在层流柜或培养器上。将制备阶段制备好的样品不超过0.1ml的样品在介质表面撒开，每种介质每个等级的溶液至少要有两个皮氏培养皿。用倾倒平板法中所说的方法培养并计算集落数。
最可能数目法.表2.6.12.-1.最可能细菌的数值
每个级别稀释液3个试管
阳性管的数目 MPN
每克 类别 95%的可信限
0.1g 0.01g 0.001g 1 2
0 0 0 ﹤3 - -
0 1 0 3 x ﹤1 17
1 0 0 3 x 1 21
1 0 1 7 x 2 27
1 1 0 7 x 2 28
1 2 0 11 x 4 35
2 0 0 9 x 2 38
2 0 1 14 5 48
2 1 0 15 x 5 50
2 1 1 20 x 8 61
2 2 0 21 x 8 63
3 0 0 23 x 7 129
3 0 1 38 x 10 180
3 1 0 43 x 20 210
3 1 1 75 x 20 280
3 2 0 93 x 30 390
3 2 1 150 x 50 510
3 2 2 210 x 80 640
3 3 0 240 x 100 1400
3 3 1 460 x 200 2400
3 3 2 1100 x 300 4800
3 3 3 ﹥1100 - -
1类：从95%的试验中获得的常规结果。
2类：不太可能的结果，从4%的试验中得到的结果。
这不用于重要的决定。比第二类更不可能发生的结果在这里没有提到，这经常是不可接受的。
最可能数目方法的精确度和准确度比薄膜过滤法和平板计数法小。不可靠的结果的获得特别是模具的列举。由于这个原因MPN法式在没有其它方法可用时的保留方法。假如方法的使用时合理的，根据以下操作。
至少准备3个一系列的产品十倍稀释液。从每个稀释水平，将1g或者1ml三等分用于接种3管9-10ml适宜的液体培养基（例如肉汤培养基A），如果有必要，可以加入表面活性剂例如吐温80，或者抗菌剂的抑制剂。应此，如果3个稀释水平的溶液被制备，这接种9个管子。所有管子在30-35°C孵化5天，记录表现微生物生长的管子的数目。如果由于该待测产品的性质致使结果难以读取，在同一肉汤介质，或在适宜的琼脂培养基，（例如琼脂培养基B）在同一温度下孵育18-24h，使用这个结果。从表2.6.12. - 1确定每克或者每毫升产品的做可能细菌数。
培养媒介的有效性和计数法的正确性
在一个含有合适的液体介质的容器中分别接种试验细菌菌株，在30-35℃孵育18-24小时。接种真菌试验菌株在适当的琼脂介质（例如无抗生素的介质C），白色念珠菌在20℃至25℃孵育48小时，黑曲霉20℃至25℃，7天。

金黄色葡萄球菌 例如ATCC 6538 (NCIMB 9518,CIP 4.83)
大肠杆菌 例如ATCC 8739 (NCIMB 8545,CIP 53.126)
枯草芽孢杆菌 例如ATCC 6633 (NCIMB 8054,CIP 52.62)
白色念珠菌 例如ATCC 10231 (NCPF 3179,CIP 48.72)
黑曲霉菌 例如ATCC 16404 (IMI 149007,CIP 1431.83)

用pH=7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液制备标准悬浮液，使得每毫升有100个菌落形成单位,分别用每个微生物的悬浮液作为一种控制计数方法,在有无产品的情况下进行检测.当用膜过滤法或平板计数法测试时,任何微生物试验的计数差异因素不多于从5个接种体中计算出的值.当用最可能数值法,从接种体计算出的数值结果可信度达95%.为了测试培养基和稀释液的无菌性和操作的无菌性,使用无菌的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液作为试验制剂.必须没有微生物的生长。
结果的解释
细菌数目被认为与在琼脂B上发现的平均菌落数目相同.真菌的数目和琼脂C上的集落形成单位相同.所有存活的细菌数是上述所说的细菌数和真菌数的总和.如果有证据证明同种微生物类型生长在两种培养基上,这可能被纠正.如果数目是用最大可能数法,则结果为细菌数目.
专题文献中提到的限度解释如下:
102微生物:最大可接受限度5×102
103微生物:最大可接受限度5×103
以此类推
如果取样方案例如使用三级取样方案的话,操作程序如下:
每五个样品计算一下总的存活数.如果满足如下条件的话,物质或制剂通过测验:
1所有的单个的存活菌数目均未超过由10个或者更多因素描述限度(例如没有不可接受的样品)
2.多于两个单独的存活菌数数目在描述限度和十倍的限度之间(例如不超过两个边界样品)
溶液和培养基建议减通则2.6.13.

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B．调和法：灭菌产品的微生物测试：微生物枚举测试
1.绪论
随后描述的试验允许定量枚举在好氧条件下可能生长的嗜温细菌和真菌。
试验设计主要决定一个物质或者制剂符合已经建立的微生物质量的规定。当用于这个目的时，根据下面给出的说明操作，包括采取的样品数量，并且按照下面的说明解释结果。
该方法并不适用于包含有存活的微生物例如活性成分的产品。
其他微生物程序，包括自动化的方法，可以使用，只要已被证明其等价于药典方法。
2.通用程序
在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。
如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。如果用灭活剂达到这个目的，它的效用和毒性情况必须证明。
3.枚举法
按照描述使用膜过滤法或者平板计数法。最大可能数法的微生物法精密度最差。然而，对于特定的生物负荷很低的产品组，这有可能最适宜的方法。
方法的选择基于如产品属性，微生物限度等因素。选择的方法必须允许测试充分的样本尺寸来判断符合规范。适合的方法选择必须建立。
4.培力试验和计数法的适应性
4-1.总体考虑
试验的能力测试待测产品中微生物的存在必须建立。假如测试性能或者产品发生变化，这可能影响介绍的测试结果，那么适应性必须得到验证。
4-2.试验菌株制剂
使用试验菌株标准化的稳定的悬浮液或者将它们按以下步骤制备。种子批培养保留技术（种子批技术）被使用，因此用于接种的可用的微生物从原始的那批种子开始不超过5批。将每一批细菌和真菌试验菌株按照2.6.12.-2分开培养。
使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者磷酸缓冲溶液pH7.2来制备测试混悬液；对于混悬A，曲霉孢子，0.05%的吐温80可能会被加到缓冲溶液中。假如储存在2-8℃的条件下该混悬液2小时内或者24小时内使用。作为选择性的方案的准备，稀释植物细胞的新鲜混悬液。A尼日尔或者B枯草杆菌，一个稳定的孢子悬浮液被准备
，然后适宜体积的孢子悬浮液将被用于接种。整个验证期间这个稳定的孢子悬浮液将被保存在2-8℃的条件下。
4-3.阴性对照
为了验证试验条件，使用选择的稀释剂代替测试制剂，必须没有微生物的生长。
4-4.介质的培养能力
测试每一批准备好的培养基，脱水制备或者由描述的成分制备每一批培养基。
在表2.6.12.-2定义指导下接种部分/酪蛋白大豆肉汤消化板和具有少量微生物（不超过100个菌落形成单位）的酪蛋白大豆肉汤消化琼脂，每一个都单独使用介质部分/板。用小数目的表2.6.12.-2定义的菌种（不多于100菌落形成单位）接种沙氏-葡萄糖琼脂板，每一个单独使用一块板。接种条件见2.6.12.-2.
对于固体培养基，获得的生长结果与标准化的接种计算值差异必须不得超过两个因素。如果相比先前发生微生物生长的培养基批次，有清晰可见的微生物生长，那么液体培养基被认为是适宜的。
4-5.计数法在存在的产品中的适应性。
4-5-1.样品的制备.样品制备的原理是根据被测样品的物理特征确定的。如果以下描述的程序都无法满足，那么相关的程序必须发展。
水溶性产品.溶解或者稀释（通常1：10稀释）被测产品在pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，或者大豆酪蛋白消化肉汤。如果有必要，调节pH至6.8.必要的时候，对用同一稀释液制备的溶液进一步稀释。
表2.6.12.-2.制剂和试验微生物的使用
微生物 试验菌株的制备 促进生长的能力 在存在的产品中计数法的适应性
好养微生物的总数 总酵母菌和霉菌计数 好养微生物的总数 总酵母菌和霉菌计数
金黄色葡萄球菌
例如
ATCC6538
NCIMB9518
CIP4.83
NBRC13276 酪蛋白大豆琼脂或者酪蛋白大豆肉汤
30-35℃
18-24h 酪蛋白大豆琼脂和酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
酪蛋白大豆琼脂/MPN酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
假单胞菌
例如
ATCC9023
NCIMB8626
CIP82.118
NBRC13275 酪蛋白大豆琼脂或者酪蛋白大豆肉汤
30-35℃
18-24h 酪蛋白大豆琼脂和酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天 酪蛋白大豆琼脂/MPN酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
枯草芽孢杆菌
例如
ATCC6633
NCIMB8054
CIP52.62
NBRC3134 酪蛋白大豆琼脂或者酪蛋白大豆肉汤
30-35℃
18-24h 酪蛋白大豆琼脂和酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
酪蛋白大豆琼脂/MPN酪蛋白大豆肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
白色念珠菌
例如
ATCC10231
NCPF3179
IP48.72
NBRC1594 沙氏-葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂
20-25℃
2-3天 酪蛋白大豆琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天 沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天 酪蛋白大豆琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN:没有应用 沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
黑曲霉
例如
ATCC16404
IMI149007
IP1431.83
NBRC9455 沙氏-葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂
20-25℃
5-7天，或者直到获得好的芽孢 酪蛋白大豆琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天 酪蛋白大豆琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN:没有应用 沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天

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不溶于水的非脂肪产品.混悬被测产品（通常是一份稀释成十倍的溶液待用）在pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或者大豆酪蛋白消化肉汤中。表面活性剂例如1g/ml的吐温80可能会加入来帮助可湿性差的的物质的混悬。在必要的时候，调节pH6-8.对于用同一稀释剂的溶液，如果需要，可以进一步稀释。
脂肪酸产品. 溶解于十四酸异丙酯，过滤器灭菌或者混合被测产品与最少需要量的灭菌吐温80或者另外非抑制灭菌的表面活性剂，需要的地方加热至不超过40℃，或者在例外的例子中不超过45℃。小心的混匀，必要的时候在水浴锅中保持温度。加入足量的预先温热的选择的稀释剂制成原始产品1：10的稀释溶液。小心的混合而保持形成乳液所需要的最短的时间。进一步的十倍稀释液系列可能使用选择的稀释液制备包含适宜浓度的灭菌吐温80或者另外的非抑制灭菌表面活性剂。
液体或者混悬微粒状固体.无菌转移产品至薄膜过滤仪器中或者其它灭菌容器中等待下次取样。使用所有的内容物或者从每一个测试容器中取预定的数量的计量剂量。
贴剂.撕开贴剂的保护层（‘露出内衬’），胶贴面朝上放置在灭菌玻璃或者塑料托盘上。用灭菌多孔材料盖住胶贴面，例如灭菌纱布，以防止贴剂黏在一起，转移贴剂至适宜的选择的稀释剂中，稀释剂包含有灭菌的吐温80和/或卵磷脂，用力摇晃此制剂至少30min。
4-5-2.接种和稀释按照上面（4-5-1）所述加入处理后的样品至控制量的（不包括测试材料）足量体积的微生物混悬液来获得不超过100个的菌落形成单位的微生物。接种的混悬液体积必须不超过稀释产品体积的1%。
为了显示可接受微生物从产品中的复苏，样品制剂的最低可能稀释剂因子必须用于试验。在由于抗微生物活性或者较差的溶解性而不可能发生的地方进一步适宜的方案必须发展。如果被样品抑制生长不能另外被避免，等分部分的微生物混悬液将被加入，在中和，稀释和过滤之后。
4-5.3.中和/除去抗菌活性.
从按照4-5-2稀释取得的产品中存活的微生物的数量,根据4-5-4程序接种，与控制制剂中获得的微生物数量比较。
如果生长被抑制（以大于2的因子减少），那么对特殊枚举试验进行修改来保证对结果的验证。程序的修改可能包括，例如，（1）稀释液或者介质的增加的体积，（2）加入指定的或者通用瓦解试剂的合并，或（4）上述措施的联合。
瓦解剂.瓦解剂可能被用于瓦解抗生素的活性（表2.6.12.-3）在消毒前他们可能被加入到选择的稀释剂或者介质。如果使用，他们对微生物的效用和没有毒性必须进行监测，并进行只有瓦解剂而无产品的空白试验。

表2.6.12.-3-常见的干扰物质的瓦解剂
干扰物质 潜在的瓦解原理
戊二醛，有机汞制剂 亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）
酚醛树脂，酒精，醛，山梨酸 稀释液
醛 甘氨酸
季铵化合物（QACs），羟基苯甲酸，2-双胍类 卵磷脂
QACs，碘，羟基苯甲酸 聚山梨酯
汞制剂 巯基醋酸酯
汞制剂，卤素，醛 硫代硫酸盐
EDTA（乙二胺四醋酸盐） 镁离子或者钙离子
如果找不到适宜的瓦解原理，假定分离生物失败是由于产品的微生物活性。此信息表示产品不太可能被特定种类微生物污染。然而，产品可能只抑制此处指出的部分微生物，但是不抑制另外没有包括在试验菌株中的微生物或者不具有代表性的微生物。然后，执行最高稀释因素，微生物的生长和具体验收标准兼容测试。
4-5-4.存在的产品中微生物的回收率
对于每一个列出的微生物都必须进行单独的试验。只有微生物附加测试菌株被计数。
4-5-4-1.膜过滤.使用有标称孔径不超过0.45μm的膜过滤器。过滤材料选择例如细菌保留功效不受被测样品的组成部分影响的材料。对列出的微生物一种微生物使用一种过滤器。
转移适宜数量的按照4-5-1至4-5-3准备的产品(最好选择1g产品作为代表，假如预期较大量集落的微生物存在，可以取少量)至膜过滤器，用适宜体积的稀释液冲洗膜过滤器。
对于好氧微生物的测定(TAMC)转移膜过滤器至大豆消化酪蛋白琼脂的表面。为了测定结合型酵母菌的总量/霉菌计数（TYMC）,转移膜至沙氏-葡萄糖琼脂表面。根据表2.6.12.-2.定义的接种板。进行计数。
4-5-4.2.平板计数.至少对每个介质重复使用平板计数法，使用结果的平均值。
4-5-4-2-1.倒板法
在一个直径为9厘米的培养皿中加入1ml的根据4-5-1至4-5-3制备的样品和15ml的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏-葡萄糖琼脂，两种介质都保存在不超过45℃的环境下。如果使用大的培养皿，琼脂的数量也相应的增加。对于每一个表2.6.12.-2中列示的微生物，至少使用两个培养皿。按照2.6.12.-2.定义接种平板。采用每个介质的算术平均值，计算原始接种中的集落数。
4-5-4-2-2.表面扩散法.
在直径9cm的培养皿中，加入15-20ml的大豆酪蛋白消化琼脂或者沙氏-葡萄糖琼脂在约45℃的环境下，并允许固化。假如使用较大的培养皿，那么琼脂的体积也相应的增加。干燥平板，例如在层流空气流柜或者培养箱内。对于在表2.6.12.-2中所列示的每个微生物种类，至少使用2个培养皿。分散已测得体积的根据4-5-1至4-5-3描述的准备的不少于0.1ml的样品在介质的表面。根据4-5-4-2-1所描述的培养和计数。
4-5-4-3.最可能数目法（MPN）MPN的精密度和准确度小于膜过滤法和平板计数法。特别是模具枚举法得到的不可靠的结果。由于这个原因MPN法是好氧微生物测定的保留方法，在没有其它方法可用的情况下可用。假如使用的方法是合理的，按照如下所述进行。
准备一系列至少3个顺序的产品的十倍稀释液如4-5-1至4-5-3所述。从每个稀释水平，3等分1g或者1ml用于接种3个装有9-10ml大豆酪蛋白消化肉汤培养基的试管。如果有必要，表面活性剂例如吐温80或者抗生素抑制剂可能被加入到介质中。因此，假如3个水平的稀释液被制备，要接种9个试管。
所有试管的接种在30-35℃下进行不超过3天的时间。如果结果读取较为困难或者由于被测产品的性质而不确定 ，在同样的肉汤培养基内次培养，或者在大豆酪蛋白消化肉汤中相同温度下培养1-2天，使用此结果。从2.6.12.-4.测定每g或者每ml被测产品中最有可能的微生物数量。

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4-6.结果和解释
当验证膜过滤法或者平板计数法的适应性，任何生物体试验的平均计数与4-5-2控制定义没有被测产品参与的获得的值的差异不大于因素2.当验证MPN法时接种计算值必须在控制结果的95%的置信区间内。
如果以上的验证不能满足一个或者更多描述的任何检测生物体的方法，最接近验证的方法和测试条件将被用于测试样品。
5．产品测试
5-1.用于测试的数量
除非另有指定，使用10g或者10ml的被测产品，采取上文提到的预防措施。对于悬浮微粒状的液体或者固体，抽取10个容器的样品。对于贴剂，取样10贴。活性物质的被测的数量的减少量根据以下的条件制定：每个剂量单位的数量（例如片剂，胶囊剂，注射剂）少于或者等于1mg或者数量每g或者每ml（对于没有以剂量单位存在的制剂）少于1mg。在这样的情况下，被测数量不少于10个剂量单位或者10g或者10ml的产品。
对于用作活性物质的材料，在有样品数量限定或者批尺寸非常小的地方（例如，小于1000ml或者1000g），被测数量必须为批量的1%除非一个更小的数量是指定的或者合理授权的。
对于一批内产品实体总量少于200的产品（例如用于临床试验），样本的尺寸可能被减少到2个单位。批量少于100时为1个单位。
从大批材料或者可用制剂容器内随机的选择样本。获得要求的数量，混合充足数量容器的内容物以提供样本。
5-2.样品检查
5-2-1.膜过滤法
使用一个设计允许过滤器向介质的转移的过滤设备。使用适合如章节4所描述的方法，转移适宜数量的样品到2个膜过滤器，立即过滤。冲洗每一个过滤器根据适宜的操作程序。
对于好氧微生物的测定，转移其中一个薄膜过滤器至大豆酪蛋白消化琼脂的表面。对于测定结合型酵母菌霉菌总量的测定，转移另一个薄膜过滤器至沙氏-葡萄糖琼脂的表面在20-25℃条件下培养5-7天。计算每g或者每ml产品的集落数。
当测定透皮贴剂，过滤体积10%的如4-5-1所描述的制剂分别通过每份两个灭菌膜过滤器。测定好氧微生物时转移一张薄膜至大豆酪蛋白消化琼脂，测定结合型酵母菌霉菌总数的将另一张转移至沙氏-葡萄糖琼脂表面。

5-2-2.平板计数法
5-2-2-1.倒板法
使用章节4已经表民那个适宜的方法制备样品。为每个介质每个稀释水平至少准备两个培养皿。在30-35℃下培养大豆老戴白消化琼脂板3-5天。沙氏-葡萄糖琼脂板在20-25℃培养5-7天。选择对应某一稀释液的表现出最高群体数少于对应好氧微生物测定少于250，对应结合型酵母菌霉菌测试少于50的板。取每个培养基计数的算术平均数。计算每g或者每ml的产品的集落数。
表2.6.12.-4.-微生物的最有可能数量
观察试管的数量组合，字每个组合中表现生长 MPN每克或者每毫升的产品 95%的置信区间
每个试管产品的克数或者毫升数量
0.1 0.01 0.001
0 0 0 ＜3 0-9.4
0 0 1 3 0.1-9.5
0 1 0 3 0.1-10
0 1 1 6.1 1.2-17
0 2 0 6.2 1.2-17
0 3 0 9.4 3.5-35
1 0 0 3.6 0.2-17
1 0 1 7.2 1.2-17
1 0 2 11 4-35
1 1 0 7.4 1.3-20
1 1 1 11 4-35
1 2 0 11 4-35
1 2 1 15 5-38
1 3 0 16 5-38
2 0 0 9.2 1.5-35
2 0 1 14 4-35
2 0 2 20 5-38
2 1 0 15 4-38
2 1 1 20 5-38
2 1 2 27 9-94
2 2 0 21 5-40
2 2 1 28 9-94
2 2 2 35 9-94
2 3 0 29 9-94
2 3 1 36 9-94
3 0 0 23 5-94
3 0 1 38 9-104
3 0 2 64 16-181
3 1 0 43 9-181
3 1 1 75 17-199
3 1 2 120 30-360
3 1 3 160 30-380
3 2 0 93 18-360
3 2 1 150 30-380
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
3 3 0 240 40-990
3 3 1 460 90-1980
3 3 2 1100 200-4000
3 3 3 ＞1100
5-2-2-2.表面分散法.
使用在章节4中表现为适合的方法来制备样品，对每个介质和每个稀释水平至少准备2个培养皿。根据倒板法的描述培养和计算集落值。
5-2-3.最大可能数法
用章节4描述适宜的方法来制备和稀释样品。培养所有试管在30-35℃条件下3-5天。如果需要进行次培养，使用表现适宜的程序进行。记录每个稀释水平表现为微生物生长的试管编号。根据2.6.12.-4来测定每克或者每毫升被测产品的微生物最可能数。
5-3.结果的解释
总的好氧微生物计数（TAMC）被考虑等于使用大豆酪蛋白消化琼脂获得的集落数;如果真菌群体在此培养集中被检测，它们被作为结合型酵母菌/霉菌计数的一部分（TYMC）被认为等于沙氏-葡萄糖琼脂培养集中获得的集落数；如果这个培养基上的细菌被检测，它们被作为TYMC计数的一部分。当TYMC预期超过了可接受的标准由于细菌的生长，沙氏-葡萄糖琼脂培养基包含有抗生素的培养基将被使用。如果计数是通过MPN进行的，那么计算所得的值是TAMC。当微生物可接受的标准被描述，那么根据以下内容解释：
-101CFU:最大可接受计数=20
-102CFU：最大可接受计数=200
-103CFU：最大可接受计数=2000，等等以此类推
建议的溶液和介质通用章节2.6.13（章节B下面，调和法）

2.6.13非无菌产品的微生物试验：指定为生物的测试
这个通用章节说明了两套试验方法。第一套方法给出了测定是否符合专论的参考方法。专论中的这一节的参考因此暗示符合第一套方法。除非授权使用第二套方法。第二套方法也构成欧洲药典的官方方法，可以称为官方方法，特别是在申请市场授权时。一旦有关专论修订，就打算用第二套方法来代替第一套方法。第二套试验方法的发展是实现与日本药典和美国药典的要求协调一致。
A. 欧洲药典的方法
在这个通用章节中特定选择介质的使用被建议。所有选择介质的共同特征，亚致死受伤生物不能被检测到。亚致死受伤生物与产品质量相关的，依赖于选择性培养基的复苏必须包含在审查程序内。
如果被测产品具有抗菌活性，这必须充分瓦解。
肠杆菌和特定的其他革兰氏阴性菌
尽管试验设计用来检测属于肠杆菌科家族的细菌，一般认为另外种类的微生物（例如，气单胞菌，假单胞菌）也包括在内。
细菌检验 根据2.6.12说明制备被测产品，但使用肉汤介质D代替pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液，在35-37℃条件下混匀和培养足够时细菌复活，但又不足以使它们繁殖的时间（通常两个小时，但不能超过5个小时）。振摇容器，转移内容物产品的数量（匀浆A）相当于1g或者1ml产品至100ml增菌培养基E ，在35-37℃条件下培养18至48小时。如果没有革兰氏阴性菌在任何板上生长，那么产品就通过了试验。
定量评价.用匀浆A和/或分别含有0.1g，0.01g，和0.001g（或者0.1ml，0.01ml和0.001ml）被测产品的稀释液接种适宜数量的增菌培养基E。在35-37℃条件培养24-48小时。在琼脂介质F板上做继代培养来获得选择性的分离。在35-37℃条件培养18-24小时。较好生长的群落一般为红色或者带红色的，钙革兰氏阴性菌构成积极的结果。注意最少数量的产品给出正面的结果，最大量的产品给出负面的结果。从2.6.13.-1得出细菌最可能数目。
表2.6.13.-1
每个数量的产品获得的结果 每克产品细菌可能数
0.1g或者0.1ml 0.01g或者0.01ml 0.001g或者0.001ml
+ + + 多于103
+ + - 少于103但多于102
+ - - 少于102但多于10
- - - 少于10
当测试透皮贴剂时，根据通用方法2.6.12描述通过灭菌薄膜过滤50ml制剂B，将薄膜置于100猛烈地增菌介质E中，在35-37℃条件培养18-24小时。接种以后，铺在琼脂介质F上测定肠杆菌和其他一些革兰氏阴性菌。
大肠杆菌
根据通用方法2.6.12制备被测产品，使用10ml或者相当于1g或者1ml的数量来接种肉汤介质A，在35-37℃条件混匀，培养18-24小时。35-37℃条件条件下在琼脂介质H板上做次培养。生长出红色的，非粘液性的革兰氏阴性杆菌群落表明存在大肠杆菌。这要用适宜的生化试验证明，例如惰性生产。如果这样的群落没有出现或者生化验证试验为阴性的，那么产品通过了试验。

沙门氏菌
按一般方法2.6.12中所描述的那样制备产品,用琼脂培养基代替pH=7.0缓冲氯化钠胨,均一化,在35-37度培养18-24h,转移1ml培养好的产物到10ml肉汤培养基I中, 41-43度培养18-24h,次培养至少在琼脂培养基J琼脂培养基K琼脂培养基L中选择出两个.在35-37度培养18-72h.沙门氏菌的存在可由下列表象证明:
琼脂培养基J:发展的很好,无色菌落
琼脂培养基K:发展的很好,红色菌落,有或没有黑心
琼脂培养基L:小的,透明的,无色或粉色或不透明白色菌落,通常由一粉色或红色区域包围.
转移分离一些可疑菌落到琼脂培养基M在试管中,用表面和深度接种.如果在深度接种中而不是表面接种中颜色从红色变成黄色通常还会有气体的生成,有或没有硫化氢的形成,可以更加确定沙门氏菌的存在.可通过适当的生化或血清学测试来更精确的确认此菌的存在.如果描述的菌落不存在或者确认性的生化或血清学测试是阴性的,此产品通过试验.
铜绿假单胞菌
按一般方法2.6.12中所描述的那样制备产品, 用10ml或与1ml或1g相对应的量在100ml肉汤培养基A中培养35-37℃培养18-48h,次培养在琼脂培养基N35-37℃培养18-72h,如果没有检测到微生物的生长,产品通过测试.如果有革兰氏阴性杆菌生长,转移一些形态不同的物质,将菌落转移到肉汤培养基A中41-43℃培养18-24h。如果在41-43℃没有微生物生长,则产品通过测试.

当测试透皮贴剂时,过滤如2.6.12方法制备的A50ml,用无菌过滤膜,然后将其放在100ml肉汤培养基A中, 35-37℃培养18-48h,接种后,在琼脂培养基N上扩展
金黄色葡萄球菌
按一般方法2.6.12中所描述的那样制备产品, 用10ml或与1ml或1g相对应的量在100ml肉汤培养基A中，在35-37℃条件下培养18-48h。次培养在琼脂培养基O上在35-37℃条件下培养18-72h,革兰氏阳性球菌黑色菌落由一透明区域包围表明有金黄色葡萄球菌.可用如凝固酵素或脱氧核糖核酸酶进行恰当的生化测试进一步确定.如果描述的菌落未在琼脂培养基O上出现或确认生化测试是阴性的,则产品通过测试.
当测试透皮贴剂时,过滤如2.6.12方法制备的A50ml,通过无菌过滤膜过滤,然后将其放在100ml肉汤培养基A中, 35-37℃培养18-48h,接种后,在琼脂培养基O上铺开。

介质的有效性和选择性质及测试的合理性
从这以后进行的测试至少要在每一批无水的培养基上进行.
按如下操作进行,分别培养以下试验菌株,在包含适当介质的试管内进行, 30-35℃培养18-24h
金黄色葡萄球菌 例如ATCC6538(NCIMB9518,CIP4.83):肉汤介质A
绿脓杆菌 例如ATCC9027(NCIMB8626,CIP82.118): 肉汤介质A
大肠杆菌 例如ATCC8739(NCIMB8545,CIP53.126): 肉汤介质A
鼠伤寒沙门氏菌 没有建议的菌株（沙门氏菌对人不致病，如沙门氏菌奥博尼（NCTC6017,CIP80.39）,可能被使用）：肉汤介质A
用pH=7.0缓冲氯化钠胨将培养物稀释成不同比例使测试的悬浮液每微升包含1000存活的微生物.将每个悬浮液用相同的体积混合,用0.4 ml作为接种体在对金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,大肠杆菌,沙门氏菌的测试中,看它们在产品中存在与否,还要有其它微生物测试的阳性结果.

梭状芽胞杆菌
下面描述的测试是用以不同的目的,
第一种方法主要用于产品排除梭状芽胞杆菌是基本的而且有必要去测试它们是否存在.产品总体上可能数目较低, 第二种方法用于产气荚膜梭菌的半定量测试，同时也是产品质量的标准。
1. 梭状芽胞杆菌的测试
如方法2.6.12中所说方法制备产品。取两个相对于1g或1ml量相当的两个相同比例的产品进行测试。将其中一个加热到80℃10分钟，迅速冷却。另一个不要加热。将两个相同性质的产品转移出10ml到两个容器中（38mm*200mm）或其它恰当的容器含有100ml介质P。在无氧情况下培养48h,35-37℃.在培养后，用试管进行次培养，介质Q上已经加过庆大霉素，在无氧情况下培养48h,35-37℃。如果没有检测到有微生物生长，产品通过测试。

如果有菌生长，在培养介质Q上次培养每个不同菌落，没有庆大霉素，且同时在有氧和无氧情况下培养。只有厌氧的革兰氏阳性菌（有或没有孢子内壁）生长使产生阴性的过氧化氢酶反应，表明有梭菌肠球菌的存在。比较而言，如果必要的话，在两个板上的菌落形态且用过氧化氢酶测试去减少存活和特许厌氧的芽孢杆菌，可使产生一个阳性的过氧化氢反应。这个测试可用于琼脂上的离散菌落或随后转移到玻璃滑片上，用一滴稀释的过氧化氢溶液。产生气泡的话表明过氧化物酶反应阳性。
2.产气荚膜梭菌的数目
如方法2.6.12中所说方法制备产品,在PH7.0的缓冲氯化胨溶液中制备1：100或1：1000的溶液。按照总存活数2.6.12中所说的确定最有可能数目，在试管中用培养基R或其它带有小德拉姆电子管的适当容器。轻微振荡将其混匀，在45.5-46.5℃，培养24-48小时。容器由于硫化铁变黑且在德拉姆管中生成了气体（至少1/10体积）表明有产气荚膜梭菌的存在 。用2.6.13.-2的方法估算出此菌的最多可能数量
控制
用以下试验菌株
方法一：梭状芽孢杆菌，例如ATCC19404(NCTC532)或者CIP79.3
方法二：产气荚膜梭菌，例如ATCC13124(NCIMB6125,NCTC8237,CIP103409).
如果必要的话可联合梭状芽孢杆菌检查选择性及厌氧条件 。
表2.6.13.-2-细菌的最有可能数目（MPN）
在每个稀释水平的3个试管
阳性管数量 每克的MPN 类别 95%的置信区间
0.1g 0.01g 0.001g 1 2
0 0 0 ＜3 - -
0 1 0 3 x ＜1 17
1 0 0 3 x 1 21
1 0 1 7 x 2 27
1 1 0 7 x 2 28
1 2 0 11 x 4 35
2 0 0 9 x 2 38
2 0 1 14 x 5 48
2 1 0 15 x 5 50
2 1 1 20 x 8 61
2 2 0 21 x 8 63
3 0 0 23 x 7 129
3 0 1 38 x 10 180
3 1 0 43 x 20 210
3 1 1 75 x 20 280
3 2 0 93 x 30 390
3 2 1 150 x 50 510
3 2 2 210 x 80 640
3 3 0 240 x 100 1400
3 3 1 460 x 200 2400
3 3 2 1100 x 300 4800
3 3 3 ＞1100 - -

下列段落因信息而出版
建议的溶液及培养基
下列的溶液及培养基可满足测试中按照药典对微生物污染方面的要求。对测试的微生物有相同的营养或选择性质的其它培养基 也可以使用。
PH7.0的缓冲氯化胨溶液
磷酸二氢钾 3.6g
磷酸氢二钠 7.2g 等于0.067M的磷酸盐
氯化钠 4.3g
蛋白胨（肉或酪蛋白）1.0g
纯化水 1000ml
可向此溶液中加入表面活性剂或抗微生物的灭活剂，例如
聚山梨醇酯80 1-10g/l
通过在高压灭菌器中加热15min 121℃灭菌
肉汤培养基A（大豆蛋白消化肉汤）
胰酶水解干酪素 17.0g
大豆粉木瓜酶消化物 3.0g
氯化钠 5.0g
磷酸二氢钾 2.5g
水合葡萄糖 2.5g
纯化水 1000ml
调节PH值这样在灭菌后PH为7.3±0.2，通过在高压灭菌器中加热15min 121℃灭菌
琼脂培养基B(大豆蛋白消化琼脂)
胰酶水解干酪素 15.0g
大豆粉木瓜酶消化物 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
纯化水 1000ml
调节PH值这样在灭菌后PH为7.3±0.2，通过在高压灭菌器中加热15min 121℃灭菌
琼脂培养基C(含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基)
胨（肉和酪蛋白） 10.0g
水合葡萄糖 40.0g
琼脂 15.0g
纯化水 1000ml
调节PH值这样在灭菌后PH为5.6±0.2，通过在高压灭菌器中加热15min 121℃灭菌
在使用之前，每升琼脂迅速加入0.10g青霉素钠，和0.10g四环素灭菌溶液或者用50mg氯霉素代替，在灭菌之前。
琼脂培养基D(水合乳糖肉汤)
牛肉膏 3.0g
明胶胰腺消化物 5.0g
乳糖 5.0g
纯化水 1000ml
调节PH值这样在灭菌后PH为6.9±0.2，通过在高压锅中加热15min 121℃灭菌,迅速冷却
富集肉汤培养基E(肠道菌富足肉汤)
明胶胰腺消化物 10.0g
水合葡萄糖 5.0g
脱水牛胆汁 20.0g
磷酸二氢钾 2.0g
磷酸氢二钠 8.0g
亮绿 15mg
纯化水 1000ml
调节PH值这样在加热后PH为7.2±0.2，在100℃加热三十分钟迅速冷却
琼脂培养基F(结晶紫，中性红，含有葡萄糖的胆汗琼脂)
酵母提取物 3.0g
明胶胰腺消化物 7.0g
胆汗盐 1.5g
水合乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
水合葡萄糖 10.0g
琼脂 15.0g
中性红 30mg
结晶紫 2mg
纯化水 1000ml
调节PH值这样在加热后PH为7.4±0.2，加热至沸腾，不需在高压灭菌锅中加热
肉汤培养基G(麦康凯肉汤)
明胶胰腺消化物 20.0g
水合乳糖 10.0g
脱水牛胆汁 5.0g
溴甲酚紫 10mg
纯化水 1000ml
调节PH值这样在灭菌后PH为7.3±0.2，通过在高压锅中加热15min 121℃灭菌
琼脂培养基H(麦康凯琼脂)
明胶胰腺消化物 17.0g
蛋白胨（肉或酪蛋白） 3.0g
水合乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆汗盐 1.5g
琼脂 13.5g
中性红 30.0mg
结晶紫 1mg
纯化水 1000ml
调节PH值这样在加热后PH为7.0±0.2，加热至沸腾，不需再加热
肉汤培养基I（连四硫酸盐亮绿胆汁肉汤）
蛋白胨 8.6g
干牛胆汁 8.0g
氯化钠 5.0g
胆盐 1.5g
琼脂 13.5g
中性红 30.0mg
结晶紫 1mg
纯化水 1000ml
灭菌后调节pH至7.1±0.2.一边不断振摇一边煮沸1min，然后在高压灭菌器内灭菌121℃15min。
琼脂培养基J(去氧胆酸柠檬酸琼脂)
牛肉膏 10.0g
蛋白胨（肉或酪蛋白） 10.0g
水合乳糖 10.0g
柠檬酸钠 20.0g
柠檬酸铁 1.0g
去氧胆酸钠 5.0g
琼脂 13.5g
中性红 20mg
纯化水 1000ml
在煮沸后调节PH为7.0±0.2，缓慢加热至沸腾，沸腾1min，冷却到50℃倒在培养皿中。不需用高压灭菌器加热
琼脂培养基K(木糖，赖氨酸，去氧胆汗酸琼脂)
木糖 3.5g
L-赖氨酸 5.0g
水合乳糖 7.5g
蔗糖 7.5g
氯化钠 5.0g
酵母提取物 3.0g
酚红 80mg
琼脂 13.5g
去氧胆汁酸钠 2.5g
硫代硫酸钠 6.8g
柠檬酸铁铵 0.8g
纯化水 1000ml
在加热后调节PH 7.4±0.2，加热至沸腾，冷却到50度倒入培养皿内。
不需用高压灭菌锅加热 。