【第二届原创大赛参赛作品】浅谈亲水作用色谱（HILIC）及其与质谱联用技术

3.HILIC影响保留的主要因素
普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。
影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。



Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid.

4. HILIC与RP-HPLC的比较
传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。
HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：



Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin.

另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。如图3所示：


Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm×2.1 mm, 1.7μm (A) ACQUITY UPLC BEH C18 (B) ACQUITY UPLC BEH HILIC. Peaks: 1 = acetylcholine, 2 = choline

5.HILIC与质谱技术联用
HILIC可为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留。通过优化多个色谱参数，有利于实现目标组分和基质中干扰物质的分离，从而降低基质效应的影响；而含有高比例水溶性有机相的流动相又有利于提高质谱离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。
质谱响应在某种程度上是取决于流动相中有机相的比例。采用ESI源时，毛细管中离子化的过程类似于一个电泳过程。由于毛细管被加高压，形成带电液滴。溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，当液滴表面电荷产生的库仑排斥力与液滴表面的张力大致相等时，液滴会分裂成更小的液滴，对于半径<10nm的液滴, 液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，形成了气相离子。而有机相的表面张力比水相的表面张力小得多。因此，在相同的条件下，流动相中有机相的比例越高，质谱的响应越高。从图4可以看出，在HILIC柱上的响应比在RPLC柱上的响应高出十倍左右。



Figure 4. Chromatograms comparing the retention and MS response of analyte on C18 column and HILIC column. (A) Column: 2.1×50mm, 3 m Inertsil ODS-3; mobile phase: methanol-water containing 0.2% formic acid (15:85, v/v) (B) Column: 2.1×50mm, 1.7 m ACQUITY UPLC BEH HILIC; mobile phase: methanol-water containing 0.2% formic acid (85:15, v/v)

6. HILIC柱的使用
（1）初次使用HILIC柱时，应采用50倍柱体积的乙腈-水（50:50）平衡，在进第一针前，应用初始流动相平衡20倍的柱体积。
（2）HILIC柱冲柱子时，采用的是乙腈-水（50:50）来洗去极性物质。如果解决不了问题，可以使用乙腈-水 (5:95) 来冲柱子。长时间不用时，将柱子保存在乙腈-水(95:5)中。
（3）要保证流动相中至少40%的有机相。流动相中使用添加剂时，醋酸铵、甲酸铵的重现性优于乙酸和甲酸。如必须使用甲酸等，0.2%优于0.1%，不要使用磷酸。
（4）水是最强的洗脱溶剂，所以强洗和弱洗溶剂与反相系统的正好相反：弱洗是初始流动相，即高比例的有机相。并且进样溶剂最好是100%的有机相。

HILIC？？？高级的柱子呀，先顶一下，再好好学习

学习了。请问楼主T3柱和Hilic柱的区别如何理解

如果使用乙腈-水 (5:95) 来冲柱子是否会减短柱子的使用寿命呢？

第一次听说这种色谱技术，主要应用于什么呢？学习中、、、、、、