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【实战宝典】免疫亲和柱-高效液相色谱法测定真菌毒素有哪些注意事项?
小官人
2021/03/24
私聊
液相色谱(LC)
问题描述:
在用免疫亲和柱
-
高效
液相色谱
法测定黄曲霉毒素和呕吐毒素等真菌毒素时,有哪些技术要点?特别是前处理过程、净化过程等方面。
解答:
(
1
)测定食品中黄曲霉毒素的技术要点:
a.
前处理过程:样品提取溶剂一般用甲醇或乙腈的水溶液。
GB5009.22-2016
《食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素
B
族和
G
族的测定》提取液用的是乙腈:水(
V/V
)
=84
:
16
,提取时要让提取液和样品充分混合,通常超声
20min
。净化首选相应的免疫亲和柱,操作步骤按照柱子使用说明即可。需要注意的是有机相洗脱时需要注意控制流速(控制
2~3
秒
/
滴),氮吹时气流要缓慢,不要把液体全部吹干,近干就可以,否则会严重影响回收率,最后用初始流动相定容。
b.
上机检测过程:黄曲霉毒素
B
2
、
G
2
本身就可以产生很强的荧光,不需要衍生。而
B
1
、
G
1
分子的二呋喃结构中碳碳双键的吸电子诱导效应,致使其分子荧光强度减弱,不衍生的话达不到标准限量要求。通过对双键衍生变成饱和碳碳单键可增强
B
1
、
G
1
的荧光强度,通常采用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生、柱后碘衍生和光化学衍生等,
GB 5009.22-2016
对前两种衍生步骤做了详细说明。柱前三氟乙酸衍生优点是不需要增加额外衍生设备,但操作较为繁琐,影响因素较多,增加了前处理时间以及结果不确定度。柱后碘衍生的稳定性、重现性更好,但需要增加柱后衍生设备(泵和衍生管),同时由于衍生需要在衍生管中进行,增加了柱后死体积,易造成色谱峰变宽,且碘本身容易被氧化,每次试验都要重新配置。光化学衍生是将反应线圈绕在紫外灯外,当流动相进入反应圈时,
B
1
、
G
1
被衍生成荧光较强的物质,类似与三氟乙酸的反应,但同样需要单独购买光化学衍生设备。
(
2
)测定食品中呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇
DON
)的技术要点:
a.
前处理过程:呕吐毒素极性较强,易溶于水等极性溶剂,因此
GB5009.111-2016
《食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》使用的提取试剂是水,不用甲醇或乙腈的原因是该标准
DON
是使用紫外检测器在
218nm
处测定,加入有机试剂的话会将样品中如色素等大量杂质提取出,干扰目标物检测。前处理过程也是用免疫亲和柱法,注意事项与黄曲霉毒素类似。
b.
上机检测过程:由于
DON
紫外最大吸收波长在
220nm
附近(
GB 5009.111-2016
标准使用
218nm
),流动相甲醇和水比例对
DON
与样品杂质的分离度影响很大,
218nm
波长处色谱图上会有一个很大的杂质峰(可能是与
DON
结构性质相近的能被免疫亲和柱保留洗脱的物质)。标准上给出的甲醇:水(
V/V
)
=20/80
比例是针对标准推荐的色谱柱,实验时要根据自己使用的色谱柱对流动相比例进行调节,否则很可能造成杂质峰与
DON
分离度不好,影响定性定量。有研究表明,选择
DON
次吸收波长(
240nm
),虽然
DON
响应值有所下降(能满足标准检出限要求),但该干扰杂质下降更多,也可以考虑作为备选波长。紫外相对荧光更容易受到杂质干扰,可能出现“假阳性”判定,有条件的话选用二极管阵列检测器(
DAD
)可以进行全波长扫描,得到三维谱图,有助于排除“假阳性”样品。
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谢谢分享!!!!!!!!
0
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