【“仪”起享奥运】聚合酶链式反应法鉴别之金钱白花蛇

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2024/08/08

私聊

中药/天然药检测

鉴别｜

聚合酶链式反应法。

模板DNA提取 取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取50mg，置2.0ml离心管中，加入提取缓冲液200μl（含1%聚乙烯吡咯烷酮-40和1%曲拉通 X-100的0.5mol/L氢氧化钠溶液），充分混匀；加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液（pH 8.0）800μl，混匀，离心（转速为每分钟12000转）5分钟；将上清液500μl转移至另一离心管中，加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液（pH 8.0）500μl，混匀，离心（转速为每分钟12000转）5分钟；将上清液50μl转移至另一离心管中，加入无菌双蒸水450μ1，混匀，作为供试品溶液，置一20℃保存备用。另取金钱白花蛇对照药材0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

PCR反应 鉴别引物：5’GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3’和5’GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA3’。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为25μl，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（1Ommol/L）1μl，鉴别引物（10μmol/L）各0.2μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板DNA 1μl，25%聚乙烯吡咯烷酮-40溶液1μl，10mg/ml牛血清蛋白0.5μl，无菌双蒸水18.4μ1。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反应30次（95℃30秒，60℃45秒），延伸（72℃）5分钟。

电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），胶浓度为1.5%，每100ml胶中加入10000×核酸凝胶染色剂GelRed 5μl；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样最分别为5μl，以DL2000（DNA条带从小到大分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp）作为DNA分子量标记，进行凝胶电泳检测。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在500～750bp之间应有单一DNA条带，空白对照无条带。

浸出物｜

照醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于15.0%。