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【“仪”起享奥运】脂溶性维生素的测定
小卡
2024/08/10
私聊
食品常规理化分析
核心提示:一、维生素A目前维生素A都是合成的,来源:(1)从动物肝脏中得到;(2)从维生素前体而得到(维生素前体:主要指类胡萝卜素,
一、维生素
A
目前维生素
A
都是合成的,来源:(
1
)从动物肝脏中得到;(
2
)从维生素前体而得到(维生素前体:主要指类胡萝卜素,主要是β
-
胡萝卜素)
维生素
A
的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、
液相色谱
法。
对于三氯化锑比色法适用于样品中含
V
A
高的样品,方法简便、快速、结果准确,但是对维生素
A
含量低的样品,如每克样品中含
5
~
10
μ
g
维生素
A
时,这时样品由于受其脂溶性物质的干扰,不应用比色法测定。
对于紫外分光光度法不必加显色剂显色,可直接测定维生素
A
的含量,对样品中含
V
A
低的也可以测出可信结果,操作简便、快速。
1
、维生素
A
的性质
⑴
因有许多不饱和链,故见光易分解;
⑵
在缺氧情况下,对热较稳定,对光特别敏感。如测强化奶粉时,速度要快,一般要求测定时间长短,因为时间长,见光时间长,见光分解,故测出的比出厂的含量要少;
⑶
对碱稳定;
2
、测定步骤
⑴
样品用有机溶剂萃取脂类
样品可以根据脂肪的测定处理脂肪,即索氏抽提法,采用乙醚作提取剂,也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。
⑵脂类的皂化
脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化(
50%KOH
、无水
C
2
H
3
OH
、热回流)把它们分开,得到一部分皂化物和一部分不皂化物。
皂化条件:
(
1
)
C
2
H
3
OH
︰脂类
= 8
︰
1
;
(
2
)
KOH
量
=
脂量×皂化价(
mg
)×
2.5
;
(
3
)皂化温度与时间:
70
℃、
30
分钟
在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚,防止氧化。
⑶
提取:不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。
⑷
柱层析分离干扰物质
采用柱层析分离干扰物质,如果柱层析把β
-
胡萝卜素也洗脱下来,那么这时维生素
A
与β
-
胡萝卜素就是一个混合物,还要将它们分离开。如果样品中只有维生素
A
而不含β
-
胡萝卜素时,这时可直接定容。
维生素
A
与β
-
胡萝卜素分离:
吸附剂:
8
分中性
Al
2
O
3
和
2
分碱性
Al
2
O
3
混合,装柱
分离方法:
a.
用
2%
丙酮石油醚洗β
-
胡萝卜素;
b.
用乙醚洗
V
A
。
3
、测定方法
⑴
S
b
Cl
3
比色法
维生素
A
/
CHCl
3
+
S
b
Cl
3
/
CHCl
3
→形成兰色物质→在
620
nm
有最大吸光峰
这种兰色物质不稳定,很快褪色或变成其它物质,所以在分析时最好在暗室中进行,并且做标准曲线。
计算:每百克样品含
V
A
的量
= C
×(
V1/V2
)×(
100/W
)
C
:从标准曲线上查得
V
A
的量
V
1
:
CHCl
3
定容的量
V
2
:
测定所取样液体积
⑵
紫外分光光度法
a.
原理:
V
A
为脂溶性的,测定
V
A
时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化,萃取不皂化部分,在经柱
层析除去杂质等干扰物质,在紫外
328
nm
下测定,求出含量。
b.
方法
1
)
提取及皂化
称样
10.00g
→
于烧杯中
→
加
40ml
水搅匀
→
移
250ml
分液漏斗中
→
加氨水
5ml
→
加乙醇
35ml
→
摇匀
→
用乙醚抽提(每次
40ml
抽提三次)
→
收集乙醚层
→
用
10ml
水洗乙醚层三次
→水层再
用
30ml
乙醚抽提一次
→
合并所用乙醚
→
用索氏法除乙醚→
待瓶中乙醚除尽后
→
加
30ml80%
的
KOH
→
40mlC
2
H
5
OH
→加
0.8g
焦性没食子酸
→
83
℃水浴
30
分钟(皂化脂肪)→
冷却后移入
250ml
分液漏斗中
→
加
60ml
水
→
用
40ml
乙醚抽提三次
→合并乙醚抽提液
→
用水洗至中性
→
用索氏法除乙醚
→
除去后用
5ml
石油醚溶解瓶中内容物
→
然后移入刻度试管中
2
)层析
在层析柱内装
8cm
高度中性氧化铝
→
2cm
高度碱性氧化铝及
1cm
无水硫酸钠
→
以石油醚浸透
→
装皂化后的样液慢慢于柱内→
用
1
~
2ml
石油醚洗试管
→
洗液倒入柱内,活塞打开以每分钟为
35
滴左右的速度打开,当液面降到接近硫酸钠时
→
加
5ml
石油醚→
随后用
5ml
洗脱液逐次洗涤。
层析柱上第一个黄色层析层,一般是β
-
胡萝卜素,此带在
12%
洗脱液前后洗去,收集于
10ml
容量瓶中直到流出物不呈黄色为止,此层可测β
-
胡萝卜素用,而
V
A
一般在
50%
洗脱液洗出,用
2ml
刻度吸管收集
1ml
。吸约
0.2ml
于小试管中→加
0.3ml25%
三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有
V
A
存在,故
0.5ml
用石油醚定容
10ml
。
3
)样液测定
以石油醚为空白
4
)计算
VA(I.μ
100G
)=(E×10
6
×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)
0.3
:每
0.3
μ
g V
A
相当于
1 I.
μ
E
:
消光值
W
:
样品重量(
g
)
1830
:石油醚中其消光值
1%cm
为
1830
(
I.
μ):
一个国际单位,维生素
A
相当于
0.6
μ
g
β
-
胡萝卜素。
4
、试剂
⑴
50%KOH
;⑵ 无水硫酸钠;⑶ 乙醚(不含过氧化氢);⑷ 石油醚;⑸ 苯;
⑹
45%C
2
H
5
OH
(应不含醛类物质)
酒精中含醛类的检查方法:
首先配银氨溶液,在
50%
硝酸银溶液中加入浓氨水,直到氧化银沉淀又重新溶解为止,在小试管中加
2ml
银氨溶液,加
3
~
5
滴酒精,摇匀,加
10%N
a
OH 1
滴加热,若有银镜反应,表示乙醇中含有醛。
脱醛处理:
取乙醇
2000ml
→
加
A
g
NO
3
2g
→
振摇溶解
→
加
NaOH 4g
→振摇溶解
→
过滤
→
上清液
→
蒸馏
→
即可
⑺
20
~
25% S
b
Cl
3
的
CHCl
3
先量取
100mlCHCl
3
于广口瓶中,用减差法称取一定量的干燥
S
b
Cl
3
,
S
b
Cl
3
易吸水,所以必需蒸馏重结晶后使用,一般用沙浴上加热。
二、维生素
D
维生素
D
在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多,一般成人不会缺
V
D
,而婴儿容易缺乏。
1
、操作步骤
⑴
提取
样品(奶粉)+水→混匀
在NH4OH的作用下
酪蛋白
Ca
盐溶解加入乙醇
使脂肪球分离→乙醚、石油醚萃取得到脂质(其它样品可用索氏提取得到脂质)
⑵
皂化
在奶粉中脂溶性物质有
V
D
、β
-
胡萝卜素、
V
A
、
V
E
、甾醇、脂肪。
目前皂化有三种情况:
低温(室温)
中温(
70
℃±
2
℃)
高温(
100
℃
15
min
)
低碱
低碱
低碱
回收率不完全
回收率
46%
回收率
70%
低碱
=
脂肪︰
KOH
为
1
︰
2.5
的关系
另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样,加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。
有人将上面的皂化条件互补,采用中温
-
高碱并加抗氧化剂,这样的回收率为
96.8%
,效果较好。
故皂化条件
:
70
℃±
2
℃高碱
+
抗氧化剂
⑶
萃取
⑷
除甾醇
甾醇在食品中含量较多,主要是通过柱子,这个柱子就是毛地黄皂甙。
甾醇
+
毛地黄皂甙
→
沉淀
洗脱液用乙醚︰己烷
= 1
︰
5
配制而成
甾醇︰毛地黄皂甙
= 1
︰
14
用量
⑸
皂土柱层析
当
V
D
与
V
A
共存时,须用皂土柱层析除
V
A
及
V
A
的分解产物。
测定方法有两种:
比色法:
维生素
A
/
CHCl
3
+
S
b
Cl
3
/
CHCl
3
/乙酰氮
→
形成橙黄色物质
→
500
nm
下测定
紫外分光光度法
V
D
/乙醇
→
265
nm
下测定
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