仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯

【金秋计划】大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

  • Ins_d6b56fa6
    2024/09/06
  • 私聊

食品常规理化分析

  • 大肠杆菌宿主菌株作为受体细胞,当这些受体细胞经过(CaCl2)处理时,它们的细胞膜通透性会发生暂时性的改变,从而成为能够允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

    一、感受态细胞

    1.感受态:
    受体细胞最容易接受外源基因并将其转化的一种生理状态2.感受态细胞:受体细胞通过理化方法处理,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。3.感受态菌龄:细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态和实现成功转化的关键。

    4.质粒转化:质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。



    二、感受态细胞制备的原理

    1.外源基因表达的条件:重组质粒必须通过转化进入细菌细胞内,才能进行扩增和表达,从而获得大量的克隆基因。2.感受态制备原理:将快速生长的大肠杆菌置于经低温0℃预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀(渗透作用),同时,Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞。3.质粒转化原理:感受态细胞细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激90s,细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。

    4.外源基因表达:进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将转化后的细胞在选择性培养基上(相应抗生素抗性)培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

    三、感受态细胞的制备(CaCl2法)

    1. 受体菌种活化:
    -80℃冰箱中保藏的菌株(如DH5αTop10、DE3、BL21等)LB平板(无抗性)上划线分离,放置于37℃恒温培养箱中倒置培养。2. 受体菌培养:LB平板上挑取单菌落,接种于10mLLB液体培养基中,37℃震荡培养12h左右至对数生长中后期。3. 菌种的准备:将受体菌菌悬液以2%的接种量接种于装有20mLLB液体培养基(无抗性)中,37℃震荡培养大约2-3h至OD600=0.4-0.5,菌落数108cfu/mL


    4. 感受态细胞的制备:(1)离心:把上述菌液转移至1.5mL离心管中,冰浴10min,在4℃,3000r/min,离心10min。(2)重悬冰浴:弃上清液,加入10mL预冷的0.05M 的CaCl2溶液,轻轻混匀,冰浴30min后,在4℃,3000r/min,离心10min。(3)重悬:弃上清,加入6mL预冷的含15%甘油的0.05MCaCl2溶液,轻轻混匀,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。或弃上清,加入6mL预冷0.05MCaCl2溶液,轻轻混匀,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液,直接使用。(4)分装:移液枪分装重悬液至1.5mL离心管中,每个离心管中分装50μL悬浮液。(5)保藏:标记贴标签,使之迅速冷冻,-80℃保藏备用。
    五、质粒化学转化1.取感受态:如果感受态细胞保藏于-80℃,从-80℃冰箱中取一支感受态,室温下解冻后立即冰浴;如果感受态细胞没有保藏,可以直接用于转化。2.质粒处理:一般质粒为粉末,1ng质粒添加10μL缓冲液或蒸馏水,混匀。3.转化:在含有50μL感受态细胞的离心管中加入1μL稀释后的标准质粒充分混匀,冰上静置30min。4.热击:将离心管置于42℃热击60-90s,然后迅速冰浴,使细胞冷却2-3 min。5.培养:向离心管中加入已预热的无菌LB培养基(无抗性)300μL,150rpm、37℃恒温震荡培养45min。6.涂布:吸取100μL菌液于LB固体培养基上(含抗性),用涂布器均匀涂布,放置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。
    7.转化率计算:

    转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中菌落数可计算出转化子总数和转化效率,公式如下:

    转化总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

    转化率=转化子总数/质粒DNA加入量μg

    理论上转化率最高为每微克的标准质粒转化的菌落数为1×1010

    六、注意事项

    1. 严格无菌操作


    操作过程,注意进行无菌操作,避免环境中杂菌污染。

    2.严格控制温度

    操作过程,要注意操作温度,以保持细胞的状态;

    加入抗生素时注意温度,避免过高温度导致抗生素失活。

    3. 严格控制浓度

    严格控制细胞的生长阶段和菌浓,严格控制质粒DNA的质量和浓度,以提高转化效率。



    4. 计算转化率

    记录和计算转化率的指标如转化子总数、感受态细胞总数和转化频率以评估转化效率。
猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐
举报帖子

执行举报

点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...