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【金秋计划】基于Akt/mTOR通路研究地榆皂苷II诱导肝癌细胞凋亡和自噬作用机制
城头变幻大王骑
2024/09/12
私聊
中药/天然药检测
肝癌是全球第3大癌症死亡原因,其中肝细胞癌约占所有肝癌类型的80%[1]。据世界卫生组织统计,每年因肝细胞癌死亡的人数高达83万例,且其发病率和死亡率仍呈现上升趋势,严重损害人类生命健康[2]。在慢性肝病的基础上,基因突变、表观遗传变化、信号通路失调和血管生成异常等分子机制相互作用,共同推动慢性肝病向肝细胞癌过程的发展[3]。目前肝细胞癌治疗的一线药物主要是索拉菲尼、仑伐替尼等靶向药及阿替利珠单抗、贝伐珠单抗等免疫治疗药物[4]。然而,靶向药及免疫治疗药的耐药性和不良反应导致肝细胞癌的5年生存率仍然不高。因此,亟需寻找安全性高、不良反应少的治疗药物,为肝细胞癌患者提供更有效、安全的治疗选择。
近年来,随着对肝细胞癌研究的不断深入,自噬在肝细胞癌中的作用逐渐被关注。在肝细胞癌的发展过程中,自噬一方面通过维持细胞内稳态来抑制肿瘤起始,另一方面通过影响信号通路的效应因子来抑制早期肝细胞癌的进程[5]。自噬受到多种机制的严格调控和影响,涉及自噬的几条重要信号通路有Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p53通路等[6],这些通路在肝细胞癌中异常激活,参与肝癌细胞的增殖、凋亡和自噬等生物学行为。研究表明,mTOR通路在自噬调控机制中发挥至关重要的作用[7],mTOR是自噬的负性调控因子,可以与UNC-51样激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)的丝氨酸结合抑制自噬的启动过程,也可以通过磷酸化使自噬调节复合物失活影响自噬小体的发生,磷酸化自噬相关蛋白14(autophagy-related protein 14,Atg14)、自噬和Beclin-1调节器1(activating molecule in beclin-1 regulated autophagy protein 1,AMBRA1)和核受体结合因子2(nuclear receptor binding factor 2,NRBF2)直接调节自噬的成核步骤[8]。因此,针对自噬及其机制开展治疗可能是肝细胞癌的有效对抗策略。
地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根,具有凉血止血、解毒敛疮的功效。地榆皂苷II是从地榆中提取的一种三萜皂苷类化合物,现代药理学研究发现,地榆皂苷II不仅具有抗炎、抗氧化、免疫调节的药理作用,同时具有广泛的抗肿瘤活性[9-11],能通过多种途径抑制多种癌症的发生和发展,其机制可能与阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和细胞自噬有关[12-15]。课题组前期研究发现,地榆皂苷II能够抑制小鼠肝细胞癌的发展[15]。然而,地榆皂苷II是否能通过影响Akt/mTOR通路诱导凋亡和自噬抑制肝细胞癌尚不明确。本研究中选择人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞作为研究对象,探究地榆皂苷II对肝癌细胞增殖、自噬和凋亡的影响,探讨地榆皂苷II在抗肝细胞癌方面的潜在作用机制,为将来用于临床治疗提供数据支持。
1 材料
1.1 细胞
HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所,Hepa1-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司。
1.2 药品与试剂
地榆皂苷II(批号MUST-11051204,质量分数≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司;PVDF膜(批号IPVH00010)购自美国Sigma公司;青霉素-链霉素(批号S11JV)购自上海源培生物科技股份有限公司;DMEM培养基(批号C11995500BT)、胎牛血清(批号A3160801)购自美国Gibco公司;PBS(批号WHB823K091)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;0.25%胰酶消化液(批号C0203)、RIPA组织/细胞裂解液(批号P0013C)、蛋白酶抑制剂混合物(批号P1050-1)、磷酸酶抑制剂混合物(批号P1050-2)、EdU-555细胞增殖检测试剂盒(批号C0075S)购自上海碧云天生物技术有限公司;CCK-8试剂盒(批号A311-02)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号E112-01)、高敏型ECL化学发光检测试剂盒(批号E412-01)、相对分子质量为1.8×105的蛋白marker(批号MP-102AA)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;一抗稀释液(批号G2025)、二抗稀释液(批号G2009)、高相对分子质量marker(批号26625)购自武汉赛维尔生物科技有限公司;7.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒(批号PG111)、10% PAGE凝胶快速制备试剂盒(批号PG112)、12.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒(批号PG113)购自上海雅酶生物医药科技有限公司;β-actin、Beclin1抗体(批号分别为20536-1-AP、11306-1-AP)购自美国Proteintech公司;B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、p62抗体(批号分别为ab196495、ab56416)购自英国Abcam公司;Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,Caspase-3)、Caspase-8、cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体(批号分别为5023T、9662S、4790T、9664T、4685S、4060T、2972S、5536T)购自美国CST公司;甲醇(批号10014118)购自国药集团化学试剂有限公司;山羊抗兔二抗(批号RS0002)购自美国ImmunoWay公司;Annexin V-FITC染色液(批号E-CK-A211)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
1.3 仪器
AL104型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司);HH-S型恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);CKX53型倒置生物显微镜、IX73倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);3111型CO2培养箱、Multiskan Go-1510型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Centrifuge 5424R型微量离心机(德国Eppendorf公司);SDS PAGE凝胶电泳及转膜电泳仪(美国Bio-Rad公司);BETS-M5型转移微型翘板摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);XH-C型涡旋混合器(金坛市医疗仪器厂);MINI-4K型微型离心机(杭州米欧仪器有限公司);5200型全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司);CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司);ThermoCell恒温金属浴(杭州博日科技股份有限公司)。
2 方法
2.1 CCK-8实验
将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中,贴壁生长24 h,设置对照组、不同剂量地榆皂苷II组,对照组仅加入培养基,其余各组分别加入5、10、15、20、30、40、60、80、100 μmol/L相应药物,继续培养24 h,用CCK-8试剂盒测定各组吸光度(A)值,计算细胞存活率。
细胞存活率=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)
2.2 EdU实验
将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中,贴壁生长24 h,设置对照组和地榆皂苷II(10、20、40 μmol/L)组,给药组给予相应药物,对照组仅加入培养基,继续培养24 h。将EdU稀释到2×EdU工作液(20 μmol/L),预热后等体积加入96孔板中,孵育细胞2 h后去除培养液,加入100 μL固定液(4%多聚甲醛),孵育10 min后去除固定液,用100 μL洗涤液洗涤细胞3次后每孔加入100 μL通透液(含0.3% Triton X-100的PBS),室温孵育15 min。去除通透液,每孔用1 mL洗涤液洗涤细胞2次,每次5 min。参考说明书配制Click反应液。每孔加入50 μL Click反应液,轻轻摇晃培养板后室温避光孵育30 min。洗涤液洗涤3次,吸除洗涤液后,每孔加Hoechst 33342溶液100 μL,室温避光孵育10 min。用洗涤液洗涤3次,每次3~5 min,随后进行荧光检测。
2.3 细胞凋亡检测
将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中,贴壁生长24 h,设置对照组和地榆皂苷II(10、20、40 μmol/L)组,给药组给予相应药物,对照组仅加入培养基,继续培养24 h。用胰酶消化细胞,300×g离心5 min,弃上清,收集细胞,PBS洗涤,轻轻重悬细胞,300×g离心5 min,弃上清。用PBS洗涤细胞,离心后弃上清,加入Annexin V Binding Buffer重悬细胞。细胞悬液中加入Annexin V-FITC Reagent和5 μL的碘化丙啶(PI),轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育15~20 min,立即上机检测。
2.4 Western blotting检测相关蛋白表达
将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中,贴壁生长24 h,设置对照组和地榆皂苷II(10、20、40 μmol/L)组,给药组给予相应药物,对照组仅加入培养基,继续培养24 h。加入RIPA中强度缓冲液裂解后收集细胞,使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经凝胶电泳,转至PVDF膜,加入5%脱脂奶粉,封闭1.5 h,加入一抗,4 ℃孵育过夜;洗膜3次后加入二抗,4 ℃孵育1.5 h;最后使用ECL化学发光检测试剂盒,用化学发光图像分析系统显影。
2.5 统计学分析
采用GraphPad Prism 9统计软件对实验数据进统计学分析,计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
3 结果
3.1 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响
如图1所示,与对照组比较,随着地榆皂苷II浓度的升高,HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的存活率明显降低,且呈剂量相关性。经GraphPad Prism 9软件分析,地榆皂苷II对HepG2、Hepa1-6细胞的IC50值分别为26.94、26.18 μmol/L,因此以10、20、40 μmol/L作为后续地榆皂苷II的给药剂量。
图片
3.2 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响
EdU-555阳性表示细胞正处于增殖状态,Hoechst33342阳性指示细胞为活细胞,EdU-555/Hoechst33342表示细胞的增殖率。如图2所示,与对照组比较,地榆皂苷II给药后HepG2和Hepa1-6细胞的EdU-555/Hoechst33342值明显降低(P<0.05、0.001),表明地榆皂苷II能够抑制肝癌细胞的增殖。
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3.3 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响
如图3所示,与对照组比较,地榆皂苷II给药组HepG2和Hepa1-6细胞凋亡率显著升高(P<0.01、0.001)。凋亡蛋白(包括调控凋亡的激活因子和执行凋亡的效应因子)参与细胞凋亡的过程。采用Western blotting检测地榆皂苷II对HepG2细胞和Hepa1-6细胞凋亡相关蛋白表达的影响,如图4所示,与对照组比较,地榆皂苷II给药组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05、0.01、0.001),cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05、0.01)。以上结果说明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6细胞的凋亡。
图片
图片
3.4 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞自噬的影响
采用Western blotting检测细胞中代表自噬的核心蛋白LC3II、LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达量,如图5所示,与对照组比较,地榆皂苷II给药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值明显升高(P<0.05、0.01、0.001),Beclin1蛋白表达量上升(P<0.05、0.01),p62蛋白表达量明显下降(P<0.05、0.01),表明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的自噬。
图片
3.5 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞中Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响
采用Western blotting检测地榆皂苷II给药后Akt/mTOR信号通路蛋白表达量,如图6所示,与对照组比较,地榆皂苷II给药组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值明显下降(P<0.05、0.01、0.001),表明地榆皂苷II能够抑制Akt/mTOR信号通路。
图片
4 讨论
肝细胞癌具有高发病率、高病死率的特点,虽然目前肝细胞癌研究备受关注,但其5年生存率仍为14.1%[16]。因此,迫切需要发现新的治疗策略和候选药物。近年来,地榆皂苷II在抗肿瘤方面的研究不断深入,研究发现地榆皂苷II抑制肿瘤与细胞自噬和凋亡存在紧密的关联,地榆皂苷II可通过诱导细胞凋亡来显著抑制乳腺癌MDA-MB-435细胞和胃癌BGC-823细胞的增殖[14-15],诱导自噬显著抑制结直肠癌细胞增殖[17]。课题组既往研究证明,地榆皂苷II可在体内抑制肝细胞癌,其机制可能与抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路有关[15]。然而,目前关于地榆皂苷II是否通过自噬和凋亡抑制肝细胞癌及其机制尚不明确。因此,本研究利用体外实验对地榆皂苷II刺激后肝癌细胞的增殖、自噬、凋亡及相关机制进行探究,结果表明,地榆皂苷II能抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡和自噬,其机制与抑制Akt/mTOR通路有关。
自噬又被称为II型程序性死亡,负责真核生物细胞质中细胞器、蛋白质和大分子的降解和回收。细胞中降解和回收的底物被吞噬后形成自噬体,自噬体与溶酶体结合形成自噬酶体最后降解。本研究检测了自噬中具有代表性的LC3、p62和Beclin1蛋白。Beclin1蛋白是一种自噬启动子,帮助自噬过程中囊泡的形成[18],地榆皂苷II作用于肝癌细胞后,Beclin1蛋白表达量上升,促进自噬启动,囊泡形成增多,从而自噬水平升高。在自噬形成时,LC3I通过泛素激活酶E1和泛素结合酶E2与磷脂酰乙醇胺偶联,生成LC3II,LC3II存在于自噬体的表面,负责膜的融合和选择性降解过程[19],p62在自噬体表面与LC3II相互作用后包裹进自噬体降解,与LC3II共同调节选择性降解过程[20]。地榆皂苷II给药后LC3II/LC3I值增高,p62蛋白表达量下降,促进自噬过程中自噬囊泡的融合和降解,进而促进自噬。Beclin1是自噬过程中的核心因子,已有研究证明Beclin1可以与抗凋亡因子Bcl-2相互作用,从而对凋亡过程产生影响[21]。细胞凋亡是一种生理性或病理性的程序性的死亡过程,近年来通过诱导促进癌细胞的凋亡来控制癌症一直是抗肿瘤的热点。Caspase级联反应是细胞凋亡过程的关键步骤,其启动受到抗凋亡因子和促凋亡因子Bcl-2和Bax的调节。在Caspase级联反应中,启动性Caspase包括Caspase-8、Caspase-9被激活后调控下游执行性Caspase如Caspase-3进而引起凋亡反应[22-24]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后,细胞中的Bcl-2蛋白表达量减少,Bax蛋白表达量增多,Bax蛋白在线粒体表面形成孔道,释放细胞色素C,引发Caspase级联反应,Caspase-8、Caspase-9激活进而诱导下游的Caspase-3活化为cleaved Caspase-3,切割下游多种底物,促进细胞凋亡典型形态变化。
Akt/mTOR信号通路在正常细胞生理过程中发挥关键作用,同时在多种癌症中,该通路的异常激活对自噬、细胞凋亡、化疗耐药性及转移过程产生重要影响[25]。诸多研究证据表明,Akt/mTOR途径是调控癌症细胞自噬反应的核心通路[26-28]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后,Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平显著下降,Akt/mTOR信号通路被抑制,激活肝癌细胞凋亡和自噬,抑制肝癌细胞的增殖(图7,由Figdraw绘制)。
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上述体外研究结果初步解析了地榆皂苷II抑制肝细胞癌的机制,即地榆皂苷II通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞的凋亡和自噬,抑制肝癌细胞增殖,为地榆皂苷II在肝细胞癌治疗的药物研究开发中提供了药理学证据。
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