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【金秋计划】微生物诱变育种技术原理
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2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
一、概念
1.诱变
:
通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法。简单来说,诱变就是一种使遗传物质改变的手段。
目前,主要有三种方法:紫外诱变、化学诱变和等离子体诱变。
2.育种:
通过创造遗传变异、改良遗传特性,以培育优良新品种的技术。育种的目的就是改良新品种,挑选优良品种,让其朝着有利人类的方向发展。
3.微生物诱变育种:
以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变,并从突变群体中筛选出所需要的突变株,进而培育成新品种的育种方法。
在这里,作用对象为各类微生物,包括细菌、放线菌、酵母和霉菌等。
二、诱变菌悬液的标准
1.
菌悬液
将菌种接种至合适的培养基中,培养至
对数生长期
,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤两次,再用适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到1×10
6
CFU/mL-1×10
8
CFU/mL。
(1)诱变育种使用对数期菌种的原因
在对数期阶段,细菌生理状态最佳,生长迅速、代谢活跃、对诱变剂的反应敏感,使得细菌在诱变处理时更容易产生遗传变异,诱变效率高,从而增加选育出优良菌株的机会。
(2)对数期的确定
试验前,绘制生长曲线,确定对数期范围。
试验时,控制培养条件(培养基、温度、pH值等),尽量与制作生长曲线条件一致。
如果没有做生长曲线,怎么办?试验时,定期测定菌悬液中的活菌数即可判断细菌是否处于对数生长期。比如说采用血球计数板计数。
2.孢子悬浮液
对于产孢子微生物,将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生
大量孢子
,用生理盐水洗脱并离心收集。用生理盐水洗涤两次,再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散,过滤除掉菌丝体。最后用生理盐水悬浮得到均匀的孢子悬浮液,并将其浓度调整到1×10
6
CFU/mL-1×10
8
CFU/mL。
三、诱变育种方法
1.紫外诱变原理:
通过紫外线照射使DNA分子内形成嘧啶二聚体,造成DNA复制错误或阻碍碱基间的正常配对,从而引起基因突变。紫外诱变使用安全,但已发生突变的细胞遇见可见光会复活,且存活率较高。
(1)紫外诱变波长
紫外诱变的波长λ一般设定为260nm,实际上波长是253.7nm,在此波长下DNA有最大吸收峰,能够最大程度地诱发DNA结构变化,从而导致基因突变。而同时,
蛋白质的吸收峰位于280nm,又不影响蛋白质,这样可以减少对蛋白分子的干扰。
(2)紫外照射距离和功率
在诱变前,需检查紫外灯,并提前预热,保证照射过程中频率稳定,诱变效果稳定。
诱变时,要摇动培养皿中菌种,提高菌种诱变效率,也要控制紫外照射距离和照射时间。
紫外线灯的强度随着照射距离的减小而增大。当距离过近时,紫外线强度过高,可能导致微生物细胞在短时间内受到大量紫外线的照射,引起过度的DNA损伤。
(3)致死率
不同的菌种,紫外诱变致死率不同,确定致死率,可以确定诱变条件是否合适。紫外照射时间太短,突变率低,达不到预期效果;而照射时间太长,菌体有可能全部死亡。因此,要想保证高的突变率,确定致死率至关重要。研究发现,当致死率在85%左右时,诱变效果最好,正突变率最高。
(4)注意事项
紫外诱变时,一定要注意个人安全,规范佩戴好防护眼镜、防护手套和防护服等。
诱变完成,要注意避光,避免光复活。
2.
化学诱变原理:
利用化学诱变剂直接改变DNA的结构,造成DNA复制时的碱基配对错误,进而引起基因突变。
(1)常用化学诱变剂
(2)化学诱变效率
突变率较高,以点突变为主,具有专一性,而对其余部位无影响。但诱变剂毒性较大,需要严格控制化学诱变剂的浓度和作用时间。
(3)注意事项
一定要注意个人安全,规范佩戴好防护眼镜、防护手套和防护服等。
化学诱变通常不具有光复活现象,无需
避光。
3.常压室温等离子体诱变(ARTP)
原理:
一种新型高效的生物育种诱变方法,能够在大气压下产生温度在25-40°C之间具有高活性粒子浓度的等离子体射流。
这些高活性粒子(如激发态的氦原子、氧原子、OH自由基等)可以对微生物细胞产生多重作用,如造成遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白结构的改变等。
(1)
常压室温等离子(ARTP)诱变育种仪
(2)致死率(3)优势与劣势
优势:
突变率高,诱变速度快;
ARTP设备简单、操作简易、运行成本低廉;
ARTP本身对环境无污染和危害。
劣势:
设备成本较高;
需要专业的维护和保养。
(4)注意事项
严格遵守“先开电再开气,先关气再关电”的操作顺序。
需要经过培训后操作。
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