【分享】欧盟兽药检测方法（之三十二）

8.样品和取样程序
有关要求引自ISO文件78/2-1982 6.3.1节，下列注释来源于2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品性质 样品应符合64/433/EEC欧盟指令中检测肉中药物残留的要求。
8.2 样品量 样品量必须足够大,以便执行有关参考方法,以及在需要时能进行重复分析。在本方法中测定磺胺类样品体积不能少于20g肾。

9 测定步骤
9.1样品制备
样品经过Bond-Elut方法提取,然后提取物被干燥。各种浓度的混合标准品也要挥发至干。标准品和样品两者都被重新加入1mL甲醇混匀。
9.1.1 称取2.5g经化冻和切碎的样品至30mL试管中。
9.1.2加6mL 0.1mol/L醋酸:丙酮混合液(1:1,V/V),然后加12mL乙酸乙酯, 均质1分钟,在2500rmp离心15分钟。
9.1.3转移上清夜到另一个30mL试管中,对组织残渣再重复第二步骤,合并上清夜,将试管放在架子上。
9.1.4将试管架放入Cardice盒中,直到水溶液层完全冷冻结冰(至少15分钟)
9.1.5将乙酸乙酯转入另一个30mL试管中,以备净化。
9.1.6用真空装置,以1柱体积的正己烷洗涤NH2结合洗脱柱,以1柱体积的正己烷和两柱体积的5%醋酸—乙酸乙酯溶液洗涤SCX Bond Elut柱。(注意： 不能让SCX柱流干)。两柱按前后顺序组装。
9.1.7转移乙酸乙酯提取物至储液器中,并通过真空转至净化柱中。
9.1.8用2柱体积的甲醇(每次6mL)洗涤柱子。
9.1.9关闭真空泵,弃取NH2柱和储液器。
9.1.10用2柱体积的水洗SCX柱,接着用4柱体积的甲醇冲洗。(注：不能让SCX柱流干)
9.1.11从收集物上移去柱子,接上Luer注射器,然后以3mL25%氨甲醇溶液正压洗脱磺胺类到dram小瓶中。
9.1.12用N2在45-50℃水浴上将洗脱液吹干,用0.5mL丙酮溶解残渣,用巴斯德吸管转移至另外小瓶中,进一步用0.5mL丙酮冲洗,然后合并冲洗液。需要时洗脱液可在-20℃贮存过夜。
9.1.13用N2在45-50℃水浴挥发洗脱液,用1mL甲醇溶解残渣。
9.2衍生化反应
除非你已经进行过相应培训,否则不能执行本方法。阅读有关安全的章节和下列劝告。
9.2.1准备下列试剂
(a)2g diazald 溶于20mL乙醚。
(b)3g KOH溶于3mL蒸馏水,然后加入到10mL ethyl digol中。
(c)10% HCl,100mL。
9.2.2根据maker公司的说明设置微型重氮化工具。
9.2.3直到你准备对样品进行甲基化，否则产生的重氮甲烷必须通过10％的HCl，以使其无效。确保装置为此而设置。
9.2.4放试剂（b）（KOH in H2O＋ethyl digol）于反应管中。
9.2.5在反应管上方放置一个分液漏斗，此分液漏斗中放入试剂（a）（diazald in ether）
9.2.6在50-60℃水浴中加温反应管。缓慢而又仔细地加入diazald溶液，大约需要超过20分钟，一旦反应开始,重氮甲烷通过样品和标准品而产生气泡，直到溶液变成黄色。无论重氮甲烷通过样品或标准品是否产生气泡，让其通过HCl进行中和是重要的。
9.2.7当所有标准品和样品已经被衍生化，产生的重氮甲烷还应通过HCl溶液，让反应继续，直到所有的试剂用完。
9.2.8用N2浓缩衍生物至干，加入100μL丙酮重新溶解。

9.3 GC/MS分析
9.3.1.1 GC参数是
色谱柱：J&W石英毛细管柱SE-54,SE-54,15m×0.25mm
进样方式：0.5uL手动进样
温度：接口温度，270℃；进样口温度，260℃
炉温：
起始温度　　最终温度　　开始速率　　保留时间　　　总时间　
（℃）　　　（℃）　　（℃／min）　 （min）　 （min）
210　　　　 210　　 　－　　　　　 2.0　　　 2.0
210　　　　 260　　 　5　　　　　　－　　　 12.0
260　　　　 260 　　　－　　　　　5.0　　　 16.0
载气：氦气流速＝1cm3/min
柱前压＝10psi
9.3.1.2使用OV-1柱,注射甲基化的磺胺类药物混合物（10μg），CVL实验室记录了下列保留时间（min）：
磺胺：5.3　磺胺吡啶：8.8　磺胺噻唑：9.0　　磺胺嘧啶：9.9
磺胺甲基嘧啶：10.8　磺胺二甲嘧啶：11.8　　磺胺胍：12.1
磺胺甲噻二唑：15.2　磺胺二甲氧嘧啶：15.7　磺胺甲氧嗪：19.7
9.3.2质谱参数
离子化方式：EI　正离子
温度：150℃
多种方式温度：90（ 5）℃
电子倍增器：1.4KV
电子能量：70电子伏特
其它参数的设置通过仪器控制，以对适当校准物质给出理想的峰高和峰型。CVL使用PFTBA校准仪器。
9.3.3在EI方式，扫描范围为m/z＝50至500。
9.3.4分析混合的标准品（10μg/100μL），通过与那些预先设置的并存在谱库中的峰进行比较,以确证色谱峰。被GC分离后成单个的磺胺峰，以保留时间和质谱图进行定性确证。
9.3.5分析样品和标准液，以下操作是可取的:
(a)按溶液浓度依次递增的顺序分析标准溶液。
(b)每一次进样之后进一次正已烷。

10.0 结果
如果GC/MS数据符合下列判定标准，样品便被确证存在磺胺类药物。
1、 样品色谱中的峰具有与标准溶液相同的GC保留时间。
2、 样品色谱峰的质谱图与标准溶液中色谱的质谱图一致。
3、 离子与另一离子的丰度比与标准溶液中的丰度比相同。
本方法对磺胺二甲嘧啶的检出限是100μg/kg。

11. 特殊事例

12. 方法注意点


13. 质量控制
质量控制样品取自预先分析过的并发现含有磺胺二甲嘧啶并超过最大残留限量（MRL）的样品。
以预先分析过的并不含有磺胺二甲嘧啶的样品作空白样品。以100μL 2.5μg/mL的磺胺二甲嘧啶标准溶液进行添加。

14. 检测报告

15. 缩略语（略）

16. 检验流程图
样品 均质 Bond-Elut 提取



计算结果 GC/MS 衍生化