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【分享】欧盟兽药检测方法(之三十二)

管理体系认证

  • 气相色谱/质谱联用(GC/MS)确证磺胺类药物的残留(EEC,确证法 )

    Sulphonamides-Confirmation of Sulphonamides by Gas Chromatography-Mass Spectrometry
    (EEC,Cy 3.1 Confirming Method)
    安全:
    1. 有机试剂:所有的有机试剂应按危险品处理,所有步骤均应在通风橱中进行。
    2. 氨:只能在通风橱中进行,并戴防护眼镜。
    3. 均质:在通风橱中进行,以避免气溶胶。
    4. 干冰:戴厚的防护手套和防护面具,干冰如果接触皮肤上可引起灼伤和冻疮。
    5. 重氮甲烷样品准备的所有反应和使用重氮甲烷都必须在通风橱中进行,同时必须穿防护服。
    不能使用带有磨口玻璃接口的仪器,这是潜在的爆炸危险品。你应确保你和其它任何人在房间中能意识到因使用重氮甲烷而存在潜在的爆炸危险。如果不是被用于直接的甲基化反应,所有产生的重氮甲烷必须立即作销毁处理。这可通过加入稀盐酸产生气泡处理。所有的玻璃器皿在离开通风橱以前必须用盐酸清洗。

    救助:
    1.试剂、酸和碱与皮肤接触后,用充足量的水冲洗。溅到眼睛上—用水冲洗,并且立即进行医学处理。
    2.割伤—立即请求就近人员进行援助。
    3.灼伤和冷冻:在冷水下冲洗受影响部位(灼伤)或用温水冲洗受影响部位(冷伤)10分钟,并请求医学处理。

    1. 引言
    目的 依据86/496/EEC残留指令,对饲养动物样品中的磺胺类药物进行确证。
    背景 磺胺类药物是一类抗生素化合物,它们已经被用来治疗由病毒、细菌、原虫或真菌引起的疾病。如果使用超过常规治疗剂量,它们也可促进生长,因此也被加入到饲料中以增加生长速率,提高产量。
    这些物质的残留可影响消费者,有些药物可引起过敏性反应,并且有一种被怀疑为致癌剂,所以CVMP规定这些物质在人们消费的食品中残留限量水平为0.1mg/kg。进行肉品中磺胺类药物残留监控以确保消费者不食用有磺胺类药物残留的肉。
    依照国家残留监控计划,对屠宰场中肉组织中残留水平进行监控。自1998年1月1日起依据86/469/EEC欧盟指令进行监控,在英国监控计划中肾被选作检测样品组织。
    样品最初用TLC或ELISA方法进行筛选(参考方法的标准操作步骤),用HPLC方法或GC/MS方法对阳性样品进行确证(CVL,UK)。


    1. 主题内容
    本方法描述了猪肾中磺胺类药物残留总量的检测方法。

    2. 应用范围
    本方法用于猪肾中磺胺类药物残留的分析,检出限是100μg/kg或100μg/L。

    3. 参考文献
    Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.(OJ. No.118,14.4,93.pp 64-74)

    2052/VI/84 File 6.11 II-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group- “Reference Methods for Residues”, General Criteria for the establishment of Reference Methods for the Dtection of Residues.

    ISO Standad 78/2-1982 Layout for standards – Part 2: Standard for Chemical Analysis

    MAFF(1987) Working Rorty on Veterinary Residues in Animal Products Food Surveillance Paper No.22.

    Takatsuki, E and Kikuchi, T.,(1990), Gas chromatorgraphic-mass spectrometric determination of six sulfonamide residues in egg and animal tissues. J.A.O.A.C. 73, 886-892

    Simpson, R.M. ,Suhre, F.B. and Shafer, J.W. (1985), Quantitative gas chromatorgraphic-mass spectrometric assay of five sulfonamide residues in animal tissue. J.A.O.A.C. 68, 23-26

    Matusik, J.E., Sternal, R.S., Barnes, C.J. Sohon, J.A. (1990) Confirmation of identity by gas chromatography/tandem mass spectrometry of sulfathiazole, sulfamethazine, sulfachloropyridazine, and sulfademethoxine from bovine or swine liver extracts after quantisation by gas chromatography/electron capture detection.

    4. 定义
    磺胺类药物含量是指按本法该法测定的肾中磺胺类药物残留的量,表示为μg/kg。

    5. 方法提要
    肾或肌肉的干提出物,用Bond-Elut方法净化,用重氮甲烷甲基化,甲基化的提取物用GC/MS进行分析。

    6. 试剂
    6.1化学试剂
    6.1.1 Diazald (Aldrich Chemical Co Ltd)
    6.1.2 氢氧化钾
    6.1.3 乙醚
    6.1.4 Ethyl digol(卡必醇)
    6.1.5盐酸
    6.1.6甲醇
    6.1.7丙酮

    6.2标准物质
    固体磺胺可从公司购买,混合标准液的浓度为1mg/mL的各种相应磺胺的甲醇溶液。目前在CVL主要使用: 磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、 磺胺、 磺胺吡啶 、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺胍 、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧基嘧啶、磺胺喹诺啉。
    标准工作溶液为0.1μg/mL,1μg/mL,10μg/mL和100μg/mL溶液,应从贮存液进行稀释制备。

    7.仪器
    7.1微型重氮化装置 (Aldrin Chemical Co Ltd)
    7.2分液漏斗:具teflon塞,125ml
    7.3离心试管
    7.4水浴
    7.5无氧供氮装置
    7.6质谱仪:Finnigan MAT与气相色谱仪连接,并接有INCOS数据系统
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  • 一道黑

    第1楼2008/12/01

    8.样品和取样程序
    有关要求引自ISO文件78/2-1982 6.3.1节,下列注释来源于2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
    8.1 样品性质 样品应符合64/433/EEC欧盟指令中检测肉中药物残留的要求。
    8.2 样品量 样品量必须足够大,以便执行有关参考方法,以及在需要时能进行重复分析。在本方法中测定磺胺类样品体积不能少于20g肾。

    9 测定步骤
    9.1样品制备
    样品经过Bond-Elut方法提取,然后提取物被干燥。各种浓度的混合标准品也要挥发至干。标准品和样品两者都被重新加入1mL甲醇混匀。
    9.1.1 称取2.5g经化冻和切碎的样品至30mL试管中。
    9.1.2加6mL 0.1mol/L醋酸:丙酮混合液(1:1,V/V),然后加12mL乙酸乙酯, 均质1分钟,在2500rmp离心15分钟。
    9.1.3转移上清夜到另一个30mL试管中,对组织残渣再重复第二步骤,合并上清夜,将试管放在架子上。
    9.1.4将试管架放入Cardice盒中,直到水溶液层完全冷冻结冰(至少15分钟)
    9.1.5将乙酸乙酯转入另一个30mL试管中,以备净化。
    9.1.6用真空装置,以1柱体积的正己烷洗涤NH2结合洗脱柱,以1柱体积的正己烷和两柱体积的5%醋酸—乙酸乙酯溶液洗涤SCX Bond Elut柱。(注意: 不能让SCX柱流干)。两柱按前后顺序组装。
    9.1.7转移乙酸乙酯提取物至储液器中,并通过真空转至净化柱中。
    9.1.8用2柱体积的甲醇(每次6mL)洗涤柱子。
    9.1.9关闭真空泵,弃取NH2柱和储液器。
    9.1.10用2柱体积的水洗SCX柱,接着用4柱体积的甲醇冲洗。(注:不能让SCX柱流干)
    9.1.11从收集物上移去柱子,接上Luer注射器,然后以3mL25%氨甲醇溶液正压洗脱磺胺类到dram小瓶中。
    9.1.12用N2在45-50℃水浴上将洗脱液吹干,用0.5mL丙酮溶解残渣,用巴斯德吸管转移至另外小瓶中,进一步用0.5mL丙酮冲洗,然后合并冲洗液。需要时洗脱液可在-20℃贮存过夜。
    9.1.13用N2在45-50℃水浴挥发洗脱液,用1mL甲醇溶解残渣。
    9.2衍生化反应
    除非你已经进行过相应培训,否则不能执行本方法。阅读有关安全的章节和下列劝告。
    9.2.1准备下列试剂
    (a)2g diazald 溶于20mL乙醚。
    (b)3g KOH溶于3mL蒸馏水,然后加入到10mL ethyl digol中。
    (c)10% HCl,100mL。
    9.2.2根据maker公司的说明设置微型重氮化工具。
    9.2.3直到你准备对样品进行甲基化,否则产生的重氮甲烷必须通过10%的HCl,以使其无效。确保装置为此而设置。
    9.2.4放试剂(b)(KOH in H2O+ethyl digol)于反应管中。
    9.2.5在反应管上方放置一个分液漏斗,此分液漏斗中放入试剂(a)(diazald in ether)
    9.2.6在50-60℃水浴中加温反应管。缓慢而又仔细地加入diazald溶液,大约需要超过20分钟,一旦反应开始,重氮甲烷通过样品和标准品而产生气泡,直到溶液变成黄色。无论重氮甲烷通过样品或标准品是否产生气泡,让其通过HCl进行中和是重要的。
    9.2.7当所有标准品和样品已经被衍生化,产生的重氮甲烷还应通过HCl溶液,让反应继续,直到所有的试剂用完。
    9.2.8用N2浓缩衍生物至干,加入100μL丙酮重新溶解。

    9.3 GC/MS分析
    9.3.1.1 GC参数是
    色谱柱:J&W石英毛细管柱SE-54,SE-54,15m×0.25mm
    进样方式:0.5uL手动进样
    温度:接口温度,270℃;进样口温度,260℃
    炉温:
    起始温度  最终温度  开始速率  保留时间   总时间 
    (℃)   (℃)  (℃/min)  (min)  (min)
    210     210    -      2.0    2.0
    210     260    5      -    12.0
    260     260    -     5.0    16.0
    载气:氦气流速=1cm3/min
    柱前压=10psi
    9.3.1.2使用OV-1柱,注射甲基化的磺胺类药物混合物(10μg),CVL实验室记录了下列保留时间(min):
    磺胺:5.3 磺胺吡啶:8.8 磺胺噻唑:9.0  磺胺嘧啶:9.9
    磺胺甲基嘧啶:10.8 磺胺二甲嘧啶:11.8  磺胺胍:12.1
    磺胺甲噻二唑:15.2 磺胺二甲氧嘧啶:15.7 磺胺甲氧嗪:19.7
    9.3.2质谱参数
    离子化方式:EI 正离子
    温度:150℃
    多种方式温度:90( 5)℃
    电子倍增器:1.4KV
    电子能量:70电子伏特
    其它参数的设置通过仪器控制,以对适当校准物质给出理想的峰高和峰型。CVL使用PFTBA校准仪器。
    9.3.3在EI方式,扫描范围为m/z=50至500。
    9.3.4分析混合的标准品(10μg/100μL),通过与那些预先设置的并存在谱库中的峰进行比较,以确证色谱峰。被GC分离后成单个的磺胺峰,以保留时间和质谱图进行定性确证。
    9.3.5分析样品和标准液,以下操作是可取的:
    (a)按溶液浓度依次递增的顺序分析标准溶液。
    (b)每一次进样之后进一次正已烷。

    10.0 结果
    如果GC/MS数据符合下列判定标准,样品便被确证存在磺胺类药物。
    1、 样品色谱中的峰具有与标准溶液相同的GC保留时间。
    2、 样品色谱峰的质谱图与标准溶液中色谱的质谱图一致。
    3、 离子与另一离子的丰度比与标准溶液中的丰度比相同。
    本方法对磺胺二甲嘧啶的检出限是100μg/kg。

    11. 特殊事例

    12. 方法注意点


    13. 质量控制
    质量控制样品取自预先分析过的并发现含有磺胺二甲嘧啶并超过最大残留限量(MRL)的样品。
    以预先分析过的并不含有磺胺二甲嘧啶的样品作空白样品。以100μL 2.5μg/mL的磺胺二甲嘧啶标准溶液进行添加。

    14. 检测报告

    15. 缩略语(略)

    16. 检验流程图
    样品 均质 Bond-Elut 提取



    计算结果 GC/MS 衍生化

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