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【金秋计划】BCA定量后WB内参不齐的原因在这里!
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2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
常见原因:
(1)蛋白上样不均:在蛋白上样过程中,蛋白质浓度不均或上样量不一致是导致内参不齐的主要原因之一。
(2)转膜效率不均:蛋白从胶到膜的转移效率不同,尤其是高分子量蛋白和低分子量蛋白的转移效率差异明显,导致内参蛋白信号的不一致。
(3)膜的处理不当:尼龙膜和PVDF膜在处理过程中,若洗膜不彻底或封闭不完全,会导致背景噪音增加,从而影响内参蛋白信号的均一性。
(4)抗体孵育不均:一抗和二抗的孵育不均,或抗体浓度不合适,均可能导致内参蛋白信号出现不均现象。
(5)蛋白发生降解:样本储存不当或处理过程中蛋白酶活性未被抑制,会导致内参蛋白部分降解,影响WB检测结果。
解决办法:
(1)确保上样量一致性。①定期校准
移液器
,确保每孔上样量的准确性。②预先进行BCA定量,标准曲线的R方值一定要在0.99以上。③确保每个样本孔中加样体积一致,常规做法是上样20-30μL,但具体体积可根据实际需求调整。
(2)优化转膜条件。①根据目标蛋白的分子量选择合适的转膜条件,对于高分子量蛋白(>100 kDa),建议延长转膜时间或提高转膜电压,例如将转膜时间延长至2 h或将电压提高至30V;对于低分子量蛋白(<30 kDa),可以缩短转膜时间至30 min或降低电压至15V。②使用合适的转膜液,常用的转膜液包括Tris-Glycine缓冲液和转膜缓冲液(如10%甲醇、0.02% SDS)。③确保转膜系统的均一性,使用均匀的电场和温度条件进行转膜,保证全程加冰低温,避免局部过热导致转膜效率不均。
(3)正确处理膜。①使用合适的封闭和洗膜条件,使用合适的封闭液(如5%脱脂奶粉、5% BSA),确保封闭时间不少于1h。使用合适的洗膜液(如TBST或PBST),确保彻底去除未结合的抗体和其他杂质,建议每次洗膜时间不少于5 min,共洗3-5次。②确保膜的均一处理,在封闭和抗体孵育过程中,确保膜完全浸在溶液中。
(4)加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。①细胞裂解后,加入适量的蛋白酶抑制剂(如PMSF),防止蛋白不断降解。②蛋白样品应尽量在-20°C下进行保存,减少蛋白降解。③ 蛋白样品制备过程中,尽量缩短处理时间,避免长时间暴露在常温条件下,减少蛋白降解。
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